Две жизни модели используются для изучения старения в С. CEREVISIAE: РЛС и CLS. Репликативной (начинающие) срок службы (РЛС) основана на наблюдении, что дрожжевые клетки матери проходят конечное число делений 3-6. Мы сосредоточимся на хронологический срок службы (CLS), модель, основанная на хронологическом выживания без деления дрожжей в культуре или по тарелкам 7-11. Дикие дрожжи типа растет в геометрической прогрессии в течение 10-12 часов в синтетических декстрозы полной (SDC) среде . Когда уровень глюкозы снижается, дрожжи переключается из ферментации дыхание, процесс, который называют diauxic смену. Клетки продолжают делиться медленно во время пост-diauxic фазы в течение примерно 48 часов перед входом G 0 ареста. Уровень метаболизма клеток остается высоким до дня 5-6 (день 0 является прививка день). Жизнеспособность клеток с течением времени могут быть доступны процент хронологически старения клеток, пробы каждые два дня, которые могут выйти G 0 ареста и образовывать колонии на богатых YPED пластин. 1. Дрожжи хронологический срок службы (CLS) в культуральной жидкости Привить одной колонии в 1 мл синтетического полной среде глюкозу (SDC, таблица 1) и инкубировать в течение ночи при встряхивании (220 оборотов в минуту) при температуре 30 ° C. Три inoculums от независимых колоний должны быть подготовлены для каждого штамма обеспечить биологическую реплик. Развести ночной культуры в свежую среду SDC (обычно 10 мл), OD = 0,05-0,1 (~ 1:100 разведение) и инкубировать при встряхивании (220 оборотов в минуту) при температуре 30 ° C. На этот раз точка считается день 0 хронологического старения. Поддерживать соотношении 1:5 культуры / колбы объемом (10 мл культуры в 50 мл, или на более длительный / большие эксперименты 25 мл культуры в 125 мл) для обеспечения надлежащей вентиляции. Начиная с 3-й день, удалить 2 аликвоты 10 мкл из колбы, развести 10000 раз в автоклаве воды, 10 мкл разведенного культуры (т. е. 10 4 -10) на YEPD (1% дрожжевой экстракт, 2% Бакто пептон, 2% раствором декстрозы , 2% агара), плиты, и инкубировать при 30 ° С в течение 48-72 часов до колониеобразующих объединиться (CFU) учитывается. День 3 КОЕ считается 100% выживаемости. Разведение факторов старения культуры в последующие дни должны быть соответствующим образом скорректированы для обеспечения ~ 20-100 колоний в анализе КОЕ (например, 10 4 -10, 10 4 -30, 10 3 -10 и др.). Для дикого типа в клетки DBY746 фон, CLS достигает 1% выживаемости около 11-й день. Вариации на месте анализа жизнеспособности включают в себя: Ограничение калорий (CR) глюкозой ограничений. Разбавление ночной культуры в среде глюкозы ограниченной SC (например, 0,5 или 0,05% вместо стандартных 2% глюкозы) в целом приводит к снижению плотности населения насыщения на 3 день, но значительно расширена средняя и максимальная (10% выживаемости) срок службы 12. Для экстремальных CR / голода, мыть день 3 стационарных культуры фазы (как правило, 10 мл, как в шаге 3 выше) с автоклавного воды (ресуспендирования клеток равным объемом воды и спин вниз на 2500 оборотов в минуту в течение 5 минут, повторите 3 раза). Incubationof клетки в воде имитирует голода условии, что дрожжи могут столкнуться в дикой природе. Каждые два дня впоследствии, старение культуры должны быть промыты водой автоклавного и ресуспендировали в равном объеме воды, чтобы удалить какой-либо питательных веществ, освобождается от отмерших клеток лизируется. Выполнить анализ жизнеспособности путем отбора проб старения культуры, как описано выше. Это условие будет голод привели к почти удвоению среднего CLS с диким типом DBY746 штамма 12. 2. На месте анализа жизнеспособности В жидкой культуре, малая доля выживших клеток могут вновь вошел в клеточный цикл и расти используя оставшиеся питательные вещества, или те, освобождается от отмерших клеток лизируется в среде, называется фенотипом отрастания / задыхаясь 13. Мы разработали жизнеспособность-на-пластина системы, которая использует auxotrophy из DBY746 деформации (TRP1), чтобы обойти отрастания / задыхаясь задачи, а также позволяют тестирование эффект постоянного воздействия или лишение различных внешних питательных веществ или стимулов на дрожжах CLS 11. Это, в месте анализа жизнеспособности также имитирует модель репликативной продолжительности жизни, что клетки постоянно подвергаются обильным питательных веществ в течение всего срока анализа продолжительности жизни. Привить одной колонии в 1 мл синтетического полной среде глюкозу (SDC) и инкубировать в течение ночи при встряхивании (220 оборотов в минуту) при температуре 30 ° C. По меньшей мере три inoculums от независимых колоний должны быть подготовлены для каждого штамма обеспечить биологическую реплик. Давайте культуры вырастет до ~ 10 8 кл / мл (OD 600 = ~ 10), развести culturewith автоклавного воды до 100-200 cell/10 мкл (обычно 10 4-кратное разбавление) и 1000 cells/10 мкл (10 3 -кратного разбавления). Пластина две аликвоты 10-30 мкл разведенной культуры на одной пластине триптофан отсева SDC. ДляГ каждого штамма, подготовить набор из 8 до 20 пластин и маркированы в соответствии с плотностью покрытия (например, 10 в 4 раза разбавленным, пластины 10 мкл или 10 4 -10, 10 4 -30, 10 3 -10, 10 3 -30 и т.д.), которые обеспечивают 10-100 колоний можно пересчитать в ожидании снижения жизнеспособности в процессе старения. Инкубируйте пластина установлена на уровне 30 ° С в течение всего срока анализа продолжительности жизни. В день посева и каждые 2 дня, затем удалить одну пластину и по каплям добавляют 0,5 мл Триптофан (2 мг / мл), чтобы жизнеспособные клетки расти. Инкубируйте планшет при 30 ° С в течение дополнительных 48-72 часов. Граф КОЕ на жизнеспособность в день того триптофан. КОЕ в день покрытие считается 100% выживаемости. Вариации на месте анализа жизнеспособности включают в себя: Возраст клеток на агар пластин (экстремальных условиях голода). Добавить 1 мл 2 раза YPED вместо триптофана в последующие дни, чтобы рост и КОЕ счет 14. Возраст клеток на пластинах с триптофаном отсева синтетических полной среде с различными источниками углерода, например, различные концентрации глюкозы (ограничение калорий глюкозой ограничения), различные источники углерода, такие как этанол, глицерин, уксусную кислоту 14. Добавьте 1 мл глюкозы / триптофан раствор (20% глюкозы и 1mg/ml триптофан), чтобы рост и КОЕ считается. Другие питательные манипуляции, такие как азот. 3. Повреждение ДНК и частоты мутаций в хронологическом старения Canavanine сопротивления (Может г) и секвенирования can1 Спонтанная частота мутаций может быть оценена путем измерения частоты canavanine сопротивления (Может г) в хронологическом старения культур. Мутации в CAN1 (YEL063) гена, который кодирует плазма аргинина permease, оказывают клетки устойчивыми к аргинин аналог L-canavanine.Can т колонии собраны в различные моменты времени могут быть сохранены для извлечения геномной ДНК и последующего секвенирования CAN1 ген, который может обеспечить мутации спектр данных (с Мутация Surveyor, SoftGenetics). База замен (Trp + реверсия) Штаммы с TRP1-289 содержат мутацию янтаря (C403T) в TRP1 кодирующей последовательности. Измерение частоты TRP1-289 для Trp + возврат 15 позволяет оценить базовую ставку замены в течение дрожжей старения хронологическом порядке. Каркасно-сдвиг мутации Lys – штамм EH150 (Мата, lys2ΔBglII, TRP1-Δ, his3-Δ200, URA3-52, ade2-1o) гаваней lys2ΔBgl мутации II, который был построен, вставив 4 нуклеотидов создать ограничение Bgl II фермента сайта в LYS2 гена . В результате +4 сдвиг в открытой рамки считывания результатов в auxotrophy для лизина, которые могут быть отменены небольшие вставки / удаления мутации 16-17. Валовой хромосомных перестроек (ГКЛ) Для определения валового хромосомных перестроек (ГКЛ), мы получили мутантный штамм, в котором HXT13 (YEL069), кодирование высоко избыточные гексоз транспортер, была нарушена URA3 кассеты 18. HXT13 находится 7,5 кб теломерных к CAN1 на хромосоме В. Мутации в обоих CAN1 и URA3 генов клетки оказывают сопротивление L-canavanine и 5-fluoroorotic кислоты (5FOA), соответственно. Учитывая низкую частоту точечные мутации, которые происходят в обоих генов, анализ Может 5FOA т т частоты обеспечивает оценку ГКЛ, что приведет к потере обоих генов. Гомологичные и homeologous рекомбинации Для контроля уровня гомологичных (100%) и homeologous рекомбинации (91%) в течение хронологического старения, мы получили мутанты, в которых линеаризованной плазмиды (HIS3:: интрон-ИК-URA3), несущих 100% гомологичными инвертированные повторы (IRS) (pSR406 ) или 91% homeologous IRS (pSR407) на HIS3 локус 19. Рекомбинация между НП позволяет выразить функциональный белок His3. Параллельно с нормальным анализа жизнеспособности (как описано выше), удалить соответствующее количество клеток от старения культуры, для мутации Может г, начинаются с ~ 2х10 7 клеток (200 мкл 3-й день культуры); для возврата Trp +, начните с ~ 10 8 клеток (500-1000 мкл 3-й день культуры); для Lys + сдвига рамки мутации, начните с ~ 10 8 клеток (500-1000 мкл 3-й день культуры); для ГКЛ, начните с 2-3х10 8 клеток (2-3 мл 3-й день культуры); для гомологичной рекомбинации и homeologous, начните с & тильда; 5х10 7 клеток (200-500 мкл 3-й день культуры); настроить покрытие суммы по снижению общего жизнеспособность и увеличение частоты мутаций в хронологическом старения (табл. 2). В случае штаммов с hypermutator фенотип (например, с недостатками в репарации ДНК), уменьшить количество выборки соответственно. Гранул клеток с настольная машина центрифуга (6000 оборотов в минуту в течение 5 мин). Ресуспендируют клеток в 1 мл автоклавного воды и гранул клетки снова. Ресуспендируют осадок клеток в 100 мкл воды. Пластина клетки, Может для т мутации, на аргинин-отсева синтетических полный пластин среды (SDC-Arg, дополненной 60 мкг / мл L-canavanine сульфата); для возврата Trp +, на триптофан-отсева пластин (SDC-Trp); для Lys + сдвига рамки мутация, по лизин-отсева пластин (SDC-Lys); для ГКЛ, на аргинин-отсева пластин (SDC-Arg) с добавлением 5FOA (1 мг / мл) и L-canavanine сульфата (60 мкг / мл); для гомологичной рекомбинации и homeologous, на гистидин-отсева пластин дополнен галактозы (2%). Граф CFUs после инкубации 3-4 дней при температуре 30 ° C. Частота мутаций нормирована на количество жизнеспособных клеток. В дополнение к на месте анализа жизнеспособности, возраст-зависимых Trp + реверсии, Lys + сдвига рамки мутации, рекомбинации, или Может г может быть исследована в клетках, в возрасте от пластины. Пластина клеток (~ 10 8 клеток / пластину) на Trp-, Lys-Его-отсева, или L-canavanine синтетических полный пластин среды (как описано выше). Каждые два дня (или в момент достопримечательность), оценка вновь возникающих колоний. Мутация частота оценивается нормализации вновь возникающих колонии общего числа жизнеспособных клеток определенный день. 4. Translesion синтеза (TLS) Возраст-зависимых частоты мутаций может привести к увеличению увеличился макромолекулы повреждений, уменьшилось сотовой защиты / восстановления и увеличения ошибочной репарации ДНК (например, Polζ-зависимый синтез translesion, TLS) в процессе старения. Например, долгоживущие sch9 Δ мутантов выставку повышенную экспрессию SOD2, а также снижение экспрессии ошибок репарации ДНК фермент rev1 20. Здесь мы опишем анализ сочетания повреждений ДНК-матрицы и весь ядерный экстракт оценить TLS в пробирке. Подготовка ядерный экстракт, как описано Ван и др. 21;. Количественно концентрации белка по BCA анализа (Pierce). Добавить 0, 5, 10 или 20 мкг ядерных экстрактов до 50 мкл (конечный объем) реакции содержащие TLS буфера (20 мМ HEPES, 7 мМ MgCl 2, 1 мМ DTT, 25 мМ NaCl, рН 7,8), 200 μMdNTPs и 100 нм 5'-32 P-меченых 12-Мер праймера (5'-CGA TGG TAC GGA-3 ') отожженного до 48-Мер шаблон, содержащий повреждение ДНК, представляющие интерес (5'-TCG ATA КТГ GTA CTA ATG ATT AAC GAC ТХА AGC ACG TCC GTA ОСО TCG-3 », в которой X является поврежденный участок, например, abasic сайт, 8-оксо-G и т.д.). Выдержите смесь при температуре 30 ° С в течение 30 мин, прекратить реакции с добавлением 2,5 мкл ЭДТА (20 мм) и 2 мкл протеиназы К (10 мг / мл). Purify ДНК с фенолом добычи и осаждением этанолом. Ресуспендируют ДНК в 50 мкл буфера загрузки гель (98% формамида, 20 мМ ЭДТА, и краситель). Решение translesion продуктов синтеза на 19% гель полиакриламида. Количественная TLS использованием phosphorimaging (рис. 1). 5. Представитель Результаты Мы обычно используется КОЕ рассчитывает на 3-й день, как на 100 процентов выживания в стандартных анализа жидкостей CLS. Процент выживания в последующие дни могут быть установлены для расчета среднего (50% выживаемости) и максимальный (10% выживаемости) продолжительность жизни 12. Продолжительность жизни результаты, полученные на месте анализа жизнеспособности в целом согласуются с тех, кто использует жидкий анализа CLS, но с уменьшенной средней продолжительности жизни, что связано отчасти с тем, что клетки постоянно подвергаются питательные вещества. Наличие глюкозы ингибирует активность клеточных защиты, как показал на снижение трансактивацию стрессовую реакцию транскрипционных факторов, таких как Msn2 / 4 и Gis1 12. Зависящими от возраста частота мутаций сильно варьируется в зависимости от штамма фон, генетические манипуляции, условия культивирования и возраста. В таблице 2 приведены типичные результаты, полученные в штамма дикого типа (DBY746). Компонент г / л D-глюкозы 20 Сульфат аммония 5 Азот базы (-AS/-AA) 1,8 NaH2PO4 1,4 мг / л Аденин 80 L-аргинин 40 L-Аспарагиновая кислота 100 L-глутаминовая кислота 100 L-Гистидин 80 L-изолейцин 60 L-лейцин 120 L-лизин 60 L-метионина 80 L-фенилаланин 60 L-серин 400 L-Треонин 200 L-триптофан 80 L-тирозин 40 L-валин 150 Урацил 80 Таблица 1. Синтетический полной среде глюкозы, SDC (приспособиться к рН 6,0 с NaOH). 4-кратное превышение гистидин, лейцин, триптофан и урацил включены, чтобы компенсировать auxotrophy из DBY746 напряжения. День 3 (среднее ± SEM) До (при старении) Может т 1,76 ± 0,12 x10 -6 6-8 х10 -6 Trp + возврат 6,60 ± 1,70 х10 -8 1,60 х10 -6 Lys + сдвига рамки мутации 3,00 ± 0,78 х10 -8 0,70 х10 -6 ГКЛ 0,62 ± 0,10 х10 -8 0,30 х10 -6 Гомологичной рекомбинации 5,55 ± 2,74 x10 -6 27,00 х10 -6 Homeologous рекомбинации 0,12 ± 0,04 x10 -6 0,48 х10 -6 Таблица 2. Типичные частоты мутаций клетки дикого типа (DBY746) в течение хронологического старения. Рисунок 1. Результаты translesion синтеза (TLS) 20. Ядерные экстракты из 3 дневных стационарной фазы дикого типа (DBY746) и sch9 Δ мутантных клеток инкубировали с неповрежденными или abasic сайт-шаблоны, содержащие ДНК в течение 30 мин при 30 ° С. TLS продуктов обозначены твердые (с неповрежденными шаблон) или пунктирными (с поврежденной шаблон) линий. Существовал не translesion синтез наблюдается в ядерных выписка из sch9 мутантов Δ. Бесплатный грунтовки обозначены открытые стрелки.