DNA-extractie van paraffine Embedded materiaal voor genetische en epigenetische Analyses
Summary
Deze video toont het protocol voor DNA-extractie van formaline gefixeerde in paraffine ingebedde materiaal. Dit is een multi-dagen procedure waarbij weefsel secties worden ontdaan met xyleen, gerehydrateerd met ethanol en behandeld met proteinase K te zuiveren en DNA te isoleren voor latere gen-specifieke of genome-wide analyse.
Abstract
Ziekte ontwikkeling en progressie worden gekenmerkt door frequente genetische en epigenetische afwijkingen waaronder chromosomale herschikkingen, aantal kopieën winsten en verliezen en DNA-methylatie. Vooruitgang in de high-throughput, genoom-brede profiling technologieën, zoals microarrays, hebben aanzienlijk verbeterd ons vermogen om te identificeren en op te sporen deze specifieke wijzigingen. Maar naarmate de technologie steeds beter, een beperkende factor blijft monster kwaliteit en beschikbaarheid. Bovendien, follow-up klinische informatie en ziekte uitkomsten worden vaak verzameld jaar na de eerste monster collectie. Monsters, zijn meestal in formaline gefixeerde en in paraffine ingebedde (FFPE), opgeslagen in het ziekenhuis archieven voor de komende jaren decennia. DNA kan efficiënt en effectief worden verhaald op paraffine ingebedde monsters als de juiste methode van extractie wordt toegepast. Hoge kwaliteit DNA geëxtraheerd uit goed bewaard en opgeslagen monsters kunnen ondersteunen kwantitatieve bepalingen voor vergelijkingen van normale en aangetaste weefsels en genereren van genetische en epigenetische handtekeningen 1. Voor het extraheren van DNA uit paraffine-ingebed monsters weefsel kernen of gemicrodissecteerde weefsel worden onderworpen aan xyleen behandeling, die de paraffine uit het weefsel oplost, en vervolgens gerehydrateerd met behulp van een reeks van ethanol wasbeurten. Eiwitten en schadelijke enzymen zoals nucleasen worden vervolgens verteerd door proteïnase K. De toevoeging van lysis buffer, die denaturerende middelen zoals natriumdodecylsulfaat (SDS) bevat, bevordert de spijsvertering 2. Nucleïnezuren worden gezuiverd uit het weefsel lysaat met behulp van buffer-verzadigde fenol en een hoge snelheid centrifugeren, die een bifasische oplossing genereert. DNA en RNA te blijven in de bovenste waterige fase, terwijl de eiwitten, lipiden en polysachariden worden afgezonderd in de inter-en organische-fase respectievelijk. Behoud van de waterige fase en herhaalde fenol extracties genereert een schoon monster. Naar aanleiding van fenol extractie, wordt RNase A toegevoegd aan besmettelijke RNA te elimineren. Extra fenol extracties na incubatie met RNase A worden gebruikt om de resterende enzym te verwijderen. De toevoeging van natriumacetaat en isopropanol precipitaten DNA, en de hoge snelheid centrifugeren wordt gebruikt om de DNA-pellet en vergemakkelijken isopropanol verwijdering. Overtollige zouten over van neerslag uitgevoerd kunnen interfereren met de volgende enzymatische assays, maar kan worden verwijderd uit het DNA door wassen met 70% ethanol, gevolgd door centrifugatie opnieuw pellet het DNA 3. DNA wordt opnieuw gesuspendeerd in gedestilleerd water of de buffer van keuze, gekwantificeerd en opgeslagen bij -20 ° C. Gezuiverde DNA kan vervolgens worden gebruikt in downstream toepassingen die omvatten, maar zijn niet beperkt tot, PCR, array comparative genomic hybridisatie 4 (array CGH), gemethyleerd DNA Immunoprecipitatie (MeDIP) en sequencing, waardoor een integratieve analyse van weefsel / tumor monsters.
Protocol
Discussion
Biopsie of chirurgisch weggesneden weefsels voor histopathologische analyse en diagnose zijn vaak formaline gefixeerde en in paraffine ingebedde (FFPE) voor lange termijn opslag. Met de groeiende belangstelling voor het begrijpen van de genetische basis van de ziekte, de mogelijkheid om DNA extraheren uit deze monsters is een onschatbare bron van diagnostisch materiaal dat gebruikt kan worden voor de genomische analyse en translationeel onderzoek. Historisch FFPE monsters werden niet beschouwd als een levensvatbare bron voor moleculaire analyse nucleïnezuren kunnen zwaar gemodificeerd door eiwit-nucleïnezuur en eiwit-eiwit verknoping 6. Echter, de ontdekking dat protease spijsvertering gefragmenteerde nucleïnezuren die geschikt zijn voor downstream-analyses waaronder PCR, array CGH, sequencing en methylering profilering releases, maakt het gebruik van deze waardevolle exemplaren voor genetische analyse 6.
DNA-extractie van paraffine-ingebed weefsel is een deugdelijke procedure die is gebaseerd op differentiële oplosbaarheid aan DNA te zuiveren. Geëxtraheerde DNA kwaliteit en kwantiteit en het succes van de latere DNA-amplificatie is afhankelijk van een aantal parameters voor, tijdens en na de extractie. Deze omvatten, maar zijn niet beperkt tot: type en de hoeveelheid weefsel, het type fixatief gebruikt voor weefsel behoud, de duur van de fixatie, de leeftijd van het paraffineblok en opslagcondities, evenals de lengte van het gewenste DNA-segment worden versterkt 1,7. Verwijdering van paraffine uit het weefsel is de meest kritische stap voor een succesvolle extractie als onopgelost paraffine leidt tot slechte kwaliteit staal en remming van de PCR-amplificatie.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen graag de leden van het Lam laboratorium bedanken voor hun evaluatie en kritieken van deze video en artikel. Dit werk werd ondersteund met middelen uit het Canadese Institutes for Health Research.
Materials
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
|---|---|---|---|
| Xylene | VWR | CABDH6216- 4 | – |
| 1.7 ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes | Sorenson BioScience | 11510 | – |
| Spectrafuge 16M Microcentrifuge | Labnet | C0160-B | – |
| Lysis Buffer | – | – | 10 mM Tris-HCl pH8, 100 mM EDTA pH 8, 50 mM NaCl, 0.5% SDS, 200 μg/ml Proteinase K |
| Proteinase K Stock Solution | Invitrogen | AM2548 | 20 mg/ml |
| Proteinase K Stock Solution | |||
| Buffer Saturated Phenol pH 6.6/7.9 | Fisher | BP1750I-400 | – |
| Phenol: chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1, pH 6.7/8.0) | Fisher | BP1752I-400 | – |
| RNase A | Roche | 10109169001 | 100mg |
| 3M sodium Acetate pH 5.2 | – | – | 40.81g NaOAc in 80ml Adjust to pH 5.2 with glacial acetic acid Add dH2O to 100ml Autoclave |
| ND 3300 Spectrophotometer | NanoDrop | – | – |
References
- Santos, M. C., Saito, C. P., Line, S. R. Extraction of genomic DNA from paraffin-embedded tissue sections of human fetuses fixed and stored in formalin for long periods. Pathol Res Pract. 204, 633-636 (2008).
- Hilz, H., Wiegers, U., Adamietz, P. Stimulation of proteinase K action by denaturing agents: application to the isolation of nucleic acids and the degradation of ‘masked’ proteins. Eur J Biochem. 56, 103-108 (1975).
- Sambrook, J. o. s. e. p. h., R, D. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2001).
- Kennett, J. Y., Watson, S. K., Saprunoff, H., Heryet, C., Lam, W. L. Technical demonstration of whole genome array comparative genomic hybridization. J Vis Exp. , (2008).
- Thu, K. L. Methylated DNA immunoprecipitation. J Vis Exp. , (2009).
- Tang, W. DNA extraction from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Cold Spring Harb Protoc. , (2009).
- Hongxin Fan, M. L. G., G, M. L. DNA Extraction from Paraffin-Embedded Tissues. Molecular Pathology Protocols. 49, 1-4 (2001).
