从石蜡包埋材料的遗传和表观遗传分析的DNA提取
Summary
本视频演示了从福尔马林固定石蜡包埋的材料DNA提取的协议。这是一个多天的过程中，水化组织切片用二甲苯deparaffinized，乙醇和蛋白酶K处理，净化和隔离随后的特定基因或全基因组分析的DNA。
Abstract
疾病的发生和发展的特点是频繁的遗传和表观遗传异常，包括染色体重排，拷贝数收益和损失与DNA甲基化。高通量，全基因组分析技术，如芯片，进展显着改善我们的能力，识别和检测这些具体的改动。然而，随着技术的不断提高，是一个限制因素仍然样品的质量和可用性。此外，后续的临床资料和疾病的结果往往是收集年后最初的标本采集。标本，通常福尔马林固定石蜡包埋（FFPE），存储几年到几十年在医院存档。 DNA可高效和有效地回收石蜡包埋标本，如果应用适当的方法提取。妥善保存，保存的标本中提取高质量的DNA可以支持比较正常和病变组织和代遗传和表观遗传签名 1的定量分析。从石蜡包埋样品，组织核心或显微切割组织中提取的DNA受到二甲苯处理，其中溶解的石蜡组织，然后再水化使用乙醇洗涤系列。随后消化蛋白酶K的裂解液，其中包含变性剂，如十二烷基硫酸钠硫酸钠（SDS），有利于消化2除了蛋白质和核酸，如有害的酶。核酸纯化从组织裂解液使用的缓冲区饱和的苯酚和高速离心产生一个双相的解决方案。 DNA和RNA停留在上层水相，而蛋白质，脂类和多糖间和有机相隔离的。保留的水相和反复苯酚抽提生成一个干净的样品。继苯酚抽提，RNA酶A添加到消除污染的RNA。额外的苯酚抽提用RNase孵化一个用来删除任何剩余的酶。添加醋酸钠和异丙醇沉淀DNA，和高速离心是用来沉淀的DNA和促进异丙醇去除。从降水的多余的盐会干扰随后的酶法检测，但可以从DNA，用70％乙醇洗涤，离心重新颗粒的DNA 3中删除。 DNA是重新悬浮蒸馏水或缓冲液的选择，量化，并储存在-20 ° C随后，纯化的DNA可用于下游应用，其中包括，但不仅限于，PCR，阵列比较基因组杂交（CGH阵列），甲基化DNA免疫共沉淀（MeDIP）和测序，允许组织/肿瘤样本的综合分析。
Protocol
Discussion
病理组织学分析和诊断组织活检或手术切除往往福尔马林固定，石蜡包埋（FFPE）长期贮存。随着越来越大的兴趣，了解疾病的遗传基础，能够从这些样本中提取DNA的诊断材料，可用于基因组分析和翻译研究的宝贵源泉。从历史上看FFPE样品不被认为是分子生物学分析的可靠来源，可能受到核酸蛋白核酸和蛋白质- 蛋白质连接6跨修改。然而，发现蛋白酶消化释放支离破碎核酸适合下游分析，包括阵列比较基因组杂交，PCR，测序和甲基化分析，使这些宝贵的标本的遗传分析6。
从石蜡包埋组织DNA提取是一个强大的的程序，对差的溶解度，以净化DNA依赖。提取的DNA质量和数量以及随后的DNA扩增的成功是依赖于许多参数之前，期间和之后提取。这些包括但不限于：组织的类型和数量，用于组织保存类型的固定液，固定期限，蜡块和储存条件年龄，以及所需的DNA片段的长度放大1,7。切除石蜡组织是成功提取的最关键的一步，为不溶性的石蜡样品的质量差和抑制PCR扩增。
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
此视频和文章对自己的评价和批评，我们要感谢林实验室的成员。这项工作是由加拿大卫生研究院的资金支持。
Materials
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
|---|---|---|---|
| Xylene | VWR | CABDH6216- 4 | – |
| 1.7 ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes | Sorenson BioScience | 11510 | – |
| Spectrafuge 16M Microcentrifuge | Labnet | C0160-B | – |
| Lysis Buffer | – | – | 10 mM Tris-HCl pH8, 100 mM EDTA pH 8, 50 mM NaCl, 0.5% SDS, 200 μg/ml Proteinase K |
| Proteinase K Stock Solution | Invitrogen | AM2548 | 20 mg/ml |
| Proteinase K Stock Solution | |||
| Buffer Saturated Phenol pH 6.6/7.9 | Fisher | BP1750I-400 | – |
| Phenol: chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1, pH 6.7/8.0) | Fisher | BP1752I-400 | – |
| RNase A | Roche | 10109169001 | 100mg |
| 3M sodium Acetate pH 5.2 | – | – | 40.81g NaOAc in 80ml Adjust to pH 5.2 with glacial acetic acid Add dH2O to 100ml Autoclave |
| ND 3300 Spectrophotometer | NanoDrop | – | – |
References
- Santos, M. C., Saito, C. P., Line, S. R. Extraction of genomic DNA from paraffin-embedded tissue sections of human fetuses fixed and stored in formalin for long periods. Pathol Res Pract. 204, 633-636 (2008).
- Hilz, H., Wiegers, U., Adamietz, P. Stimulation of proteinase K action by denaturing agents: application to the isolation of nucleic acids and the degradation of ‘masked’ proteins. Eur J Biochem. 56, 103-108 (1975).
- Sambrook, J. o. s. e. p. h., R, D. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2001).
- Kennett, J. Y., Watson, S. K., Saprunoff, H., Heryet, C., Lam, W. L. Technical demonstration of whole genome array comparative genomic hybridization. J Vis Exp. , (2008).
- Thu, K. L. Methylated DNA immunoprecipitation. J Vis Exp. , (2009).
- Tang, W. DNA extraction from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Cold Spring Harb Protoc. , (2009).
- Hongxin Fan, M. L. G., G, M. L. DNA Extraction from Paraffin-Embedded Tissues. Molecular Pathology Protocols. 49, 1-4 (2001).
