Keneler de RNA Girişim

1. DsRNA, Üretimi. DsRNA in vitro transkripsiyon ve sentez (örneğin, Dermacentor subolesin oligonükleotid primerler D8AAT75 variabilis için T7 promotor dizisinde içeren oligonükleotid primerler sentez: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGTACTGACTGGGATCCCCTGCACAGT-3 've D8DVT73: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGTACTCGAGCTTGGTGGAAAGGACG-3'). RT-PCR her oligonükleotid astar ve kene toplam RNA 1-10 ng 10 pmol kullanarak hedef gen artırın. PCR ürünü arındırın. DsRNA 8 mcL saflaştırılmış PCR ürünü kullanarak sentezlerler. Spektrometresi ile dsRNA sayısal olarak. 2. DsRNA ile Keneler enjeksiyon. 2.1. Keneler enjeksiyon için hazırlanması. Öncelikle, her çözüm, tek bir 50 ml santrifüj tüpüne onları sallayarak tüp üst keneler korumak için üzerine ince bir örgü tel ekran yoluyla çözüm şişeden çözümleri bir dizi keneler yıkayın. Keneler çamaşır için çözümler dizisi, musluk suyu,% 3 hidrojen peroksit, distile su,% 70 etanol ve saf su ile iki kez daha yıkar iki yıkar. Kağıt havlu üzerinde kene Blot kurulayın. Deney bağlı olarak 20 ila 50 arasında gruba keneler Sayısı 1.25 oz plastik bardak, deneysel grup numarası ile sıkı donatılmış bir kapak ve etiket ile her gruptan keneler. 2.2. Enjeksiyon ekibi işaretleyin. RNAi ekip üç kişiden oluşur: (1) kırmızı diş balmumu bir sayfasına yapıştırılmış çift yapışkan bant, her kene pozisyonları bir kişi, (2), sonra kenelerin izler ve keneler (3) bir kişi enjekte bir kişi enjeksiyon, keneler bunları etkinleştirmek için CO 2 nefes ve deneysel grup numarası ile etiketlenmiş bardak içine yaşayan keneler sayar. Tüm ekip üyeleri, tek kullanımlık eldivenler giymelidir. 2.3. Enjeksiyon için keneler yerleştirilmesi. Dumont ince forseps kullanarak kene yakalayın ve kırmızı diş balmumu 3 "x 6" levha yapıştırılmış çift yapışkan bant üzerinde ventral tarafında bir yer. Keneler 5 keneler gruplar halinde bir araya yakından konumlandırılmış. Tüm 5 kenelerin ağız onları daha da dizginlemek için küçük bir şerit üzerinde maskeleme bandı yerleştirin ama vücudun en enjeksiyon işlemi, kene enjektör (Şekil 1) tarafından görülebilir bu yüzden maruz bırakarak. 2.4. Keneler Enjeksiyon. Keneler Exoskeleton ventral yüzeyinde sağ alt kadranda enjekte edilecektir. İlk olarak, dış iskelet, ½ ", 29 gauge iğne (Şekil 2a) ile donatılmış bir Monoject insülin şırınga kullanarak bir delik delmek. 45 ° Eğimli noktası ile 1 inç, 33 gauge iğne ile ısmarlama Hamilton şırınga kullanarak (mcL başına 5 x 10 11 moleküller 5 x 10 10) (Şekil 2b) dsRNA çözüm 0.2-0.5 mcL hemen kene enjekte . Kene boşluğuna iğne dsRNA yerleştirilmesi ve saklama sigortalamak için iyi yerleştirilmiş olmalıdır. Bazı sıvı enjeksiyon yerinde (Şekil 2c) kaçmak için muhtemeldir. Üzerinde hemolimf kaybına neden olan keneler, enjekte etmek ve kene ölüme neden olabilir alınmalıdır. Hamilton şırınga her deney grubunda enjeksiyonları tamamladıktan sonra temizleyin. başka bir deney grubu için kullanmadan önce. Bir atık kabı içine kovmak ve 15 kez tekrarlayın sonra beher% 3 hidrojen peroksit içeren bir şırınga doldurun ve. Steril su içeren bir beher şırınga doldurun ve sonra bir atık kabı içine kovmak ve 15 kez tekrarlayın. Bükülmüş ise, piston düzgün hareket ve nazik bir dokunuş keneler enjeksiyon için gerekli cevap, çünkü Hamilton şırınga pistonu eğmemeye dikkat edin. 2.5. Enjeksiyondan sonra kene tedavisi. Ince forseps ile hemen çift yapışkan bant enjekte kene Pick up ve plastik bir kurtarma konteyner (yaklaşık 6 "x 6" ve keneler kaçmasını önlemek için maskeleme bandı ile halkalı) yerleştirin. Keneler, enjeksiyondan sonra kısa bir süre devre dışı olacak ama yakında çanak etrafında tarama başlamalıdır. Nefes kurtarma konteyner keneler etkinleştirilmesine yardımcı olmak için onları yerleştirerek hemen sonra kenelerin üzerine 2 CO. Sonra, tarama ve keneler aktif enjeksiyon yara hızla iyileşir ve bunlar büyük olasılıkla hayatta kalacaktır. Her deney grubu sayısına göre keneler sayın ve sıkıca monte kapaklı etiketli bir plastik bardak koyun. Yedek keneler herhangi bir sonraki deney grubu enjekte önce öldüğünü herhangi bir yerine enjekte edilmelidir. 2.6. Tutarak işaretleyin. Nem odasında keneler (12saat ışık Yeri: 22-25 az 12 saat karanlık fotoperiyodun ° C ve% 95 bağıl humidity) ve 1 gün için basılı tutun. Yeri keneler, kene besleme hücreleri için bir deney grubu, bir koyun yapıştırılmış ve onları eşit sayıda erkek veya kadın uninjected keneler (enjekte değildi hangisi seks) ile beslenirler. Tıka basa beslemek Kadın keneler, koyun, beslenme 10 gün ya da kontrolü kadın sonra çıkarılır bu konak toplanan ve tartılır düştü. Kartonları keneler yerleştirin ve koloni gelişimine tamamlanıncaya kadar nem odasında tutun. Yöntemlerinin koloni ağırlık gruptaki tüm keneler tarafından üretilen yumurta kitle tarafından değerlendirin. 2.7. RNAi sonra kene fenotip analizi. Beslenmeden sonra fenotip kene, keneler, kene kilo yöntemlerinin koloni ve yumurta doğurganlık hayatta sayısını belirleyen değerlendirin. Ancak, çalışmanın hedeflenen gen ve hedeflerine bağlı olarak diğer analizler yapılabilir. 3. RT-PCR ile gen susturma Onayla Analizi. Beslendikten sonra, kontrol enjekte ve dsRNA enjekte grupların bireysel kene tükürük bezleri ve bağırsaklar parçalara ayır. Bireysel doku örneklerinden total RNA ayıklayın. GenNorm yöntemi (Bio-Rad iQ5 Standart Edition Sürüm 2.0 tarafından uygulanan ddCT) yöntemini kullanarak gerçek zamanlı RT-PCR ile bireysel dokularda hedef gen transkript analiz ve kene 16S karşı RNA düzeyleri normale rRNA. Her örnek için aynı sıcaklık aralığında sürekli amplikonlarının doğasını sadece bir Amplikon oluşan olduğundan emin olmak için reaksiyonun sonunda ve disosiasyon eğrileri çalıştırın. MRNA düzeyleri kontrol dsRNA enjekte keneler Öğrenci `s, t-testi (P ​​= 0.05) kullanılarak enjekte arasında (normalize Ct değerleri) karşılaştırın. 4. Temsilcisi Sonuçlar: Protokolü burada RNAi için, birçok farklı ixodid kene türlerinde (Tablo 1) laboratuvarda kullanılan olmuştur nitelendirdi. Kene enjekte dsRNA miktarı kene boyutu ile değişir; büyük kene türlerinin daha büyük bir hacim barındırabilir. Negatif kontrol keneler alakasız bir dsRNA ile enjekte edilmelidir. Subolesin 14-19,22-25,27-32,34 ve beta-aktin 20,21 gibi birçok dsRNAs pozitif kontrol olarak kullanılabilir. Karıştırma dsRNA çözümler önlemek için tedaviler arasında şırınga yıkamak için önemli olduğunu unutmayın. Protokolü doğru yapılırsa,% 5 oranında daha az ölüm, 24 saat sonra enjeksiyon prosedürü elde edilmelidir. Keneler gen demonte sonra tipik bir fenotip için ekran koruyucu antijenler kene dsRNA havuzları enjekte keneler bir panel ile Şekil 3 gösterilmiştir. Türlerin işaretleyin dsRNA enjekte Referanslar Ixodes scapularis cDNA kütüphanesi, subolesin, aktin, nükleotidaz, NF-kB, akirin 21, 22, 29, 30 Dermacentor variabilis subolesin, GST, ubikuitin, vATPase, selenoproteinlerin M ve W2A, hematopoietik kök / progenitör hücreleri aktin Proteazom 26S subunit, ferritin1, varisin, akirin, protein gibi 15, 19, 22, 24, 26, 30-32 Dermacentor marginatus subolesin 22 Amblyomma americanum cDNA kütüphanesi, subolesin, akirin 17, 22, 30 Amblyomma hebraeum subolesin, voraxin 28 Rhipicephalus sanguineus Rs86, subolesin 22, 23 Rhipicephalus Microplus GST, ubikuitin, selenoprotein, Bm86, Bm91, subolesin, GI, GIII, EF1a flagelliform ipek proteini, von Willebrand faktör 16, 18, 25, 27 Rhipicephalus annulatus ubikuitin, subolesin, EF1a, GIII 16 (Tablo 1). RNAi protokolü kullanılan edildiği türlerin işaretleyin. Şekil 1 kırmızı diş balmumu bir sayfasına yapıştırılır çift yapışkan bant keneler Yerleştirme, ventral tarafta. Keneler, küçük bir şerit maskeleme bandı enjektör enjeksiyon sırasında vücut kene gözlemlemek için izin verirken, keneler daha da güvenli amacıyla ağız üzerine yerleştirilir, sonra, 5 gruplar halinde yerleştirilir. Şekil 2 enjeksiyon prosedürü insülin sy kene dış iskelet (a) sağ alt kadranda piercingringe bir enjeksiyon sitesi oluşturmak için 29 gauge iğne ile donatılmış, (b), (c) en olası kene hemolimf bazı kaçak / 33 gauge iğne ile Hamilton şırınga kullanarak bu sitede dsRNA hemen enjeksiyon akışkanlar. Şekil 3 kene altı grup RNAi Amblyomma americanum kene koruyucu antijenler için ekran için kullanılan hangi bir panel. Keneler de fenotipik değişiklikler olumlu subolesin RNAi kontrolü ve olumsuz ilgisiz dsRNA kontrol ile karşılaştırıldığında görülebilir. Bu deneyde, her grubun kene ölüm, ağırlıklar ve yöntemlerinin koloni RNAi etkisi istatistiksel olarak analiz edildi.