Summary

ロックされた核酸修飾オリゴヌクレオチドによるトランスフェクションおよび蚊細胞における標的遺伝子の変異

Published: December 26, 2010
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Summary

オリゴヌクレオチドは、特に両方でトランスフェクトされた標的遺伝子の一塩基の置換サイトに使用することができます<em>ハマダラカ</em>と<em>ハマダラカ</em>細胞。

Abstract

マラリア原虫、マラリアの原因物質は、毎年2億5千万以上の新しい感染症で、その結果感染したハマダラカ蚊の刺咬を介して送信されます。数十年にわたる研究にもかかわらず、マラリアに対するワクチンは、全く新しい制御戦略の必要性を強調し、まだありません。一つの革新的なアプローチが効果的にマラリア原虫の伝送を制御する遺伝子組み換え蚊の使用です。標的特異的変異を経由して蚊の細胞シグナル伝達経路の意図的な変化が、、寄生虫の開発1を調節することが見出されている。これらの研究から、我々は、変換のための潜在的な遺伝子標的を同定するために始めることができます。標的変異誘発は、伝統的に標的遺伝子と大きなDNA分子間の相同組換えに頼っている。しかし、安定に形質転換細胞株の生成のためのこのような複雑なDNA分子の構築および使用は、コストと時間がかかり、非効率的です。したがって、ロックされた核酸修飾オリゴヌクレオチド(LNA – ONS)を使用しての戦略はエピソームおよび染色体DNAの遺伝子標的(2レビュー)に人工的な単一の塩基置換を導入するための有用な代替手段を提供します。 LNA – ONを介した標的突然変異誘発は、酵母やマウスの3,4の両方の培養細胞で目的の遺伝子に点突然変異を導入するために使用されています。我々は、LNA – ONSがハマダラカハマダラカの細胞の両方において、緑色蛍光タンパク質(GFP)の発現に青色蛍光タンパク質(BFP)の式からスイッチの結果そのトランスフェクトされたエピソームターゲット内の単一のヌクレオチドの変化を導入するために使用できることをここに示す。この変換は、蚊細胞における標的遺伝子の効果的な変異導入がLNA – ONSによって媒介されることを初めて示し、この手法は、in vitroおよび in vivo 染色体ターゲットの突然変異誘発に適用される可能性があることを示唆している。

Protocol

前のプロトコルを開始するために、それは実験で使用されている蚊の細胞が健康と付着した場合〜80%コンフルエント(図1)が表示されていることを決定することが重要です。草に覆われたまたは不健康な細胞は、低トランスフェクション効率になりますし、矛盾した結果を返します。 30分間28℃のウォーターバスで使用する前にすべてのメディアをウォームアップ。 MEM、アー?…

Discussion

ここでは、AにLNA – ONSのトランスフェクション後エピソーム、遺伝子をターゲットに単一のヌクレオチドの標的変換のためのin vitro法と証拠提示ハマダラカA. gambiae細胞 。 LNA – ONを介した遺伝子変換は、サイト固有のDNA修復応答の誘導が必要です私たちのデータでは、蚊の細胞は、部位特異的突然変異誘発のためのこのメカニズムをサポートできることを?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我々は、フローサイトメトリーと彼女の援助のためのカリフォルニア国立霊長類研究センターでのアビースピナーを感謝したいと思います。この研究は、国立アレルギー感染症研究所(NIAID)国立衛生研究所(NIH)AI073745、AI080799、およびAI078183からの資金によって支えられている。

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Effectene transfection reagent   Qiagen 301425  
GFP control plasmid (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg)   Invitrogen K4935-00  
BFP plasmid (pcDNA5/FRT/TO)   Gift from Dr. Concordet3    
LNA-ONs   Gift from Dr. Concordet3    
MEM, Earle’s w/ glutamine   Invitrogen 11095  
Fetal calf serum (FCS)   Invitrogen 16000  
Schneider’s Drosophila medium   Invitrogen 11730  
Non-essential amino acids   Invitrogen 11140  
10% D-glucose   Sigma G5767  
Penicillin-streptomycin antibiotic   Invitrogen 15140  
6-well culture plates   Corning 3516  

References

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Citer Cet Article
Pakpour, N., Cheung, K. W., Souvannaseng, L., Concordet, J., Luckhart, S. Transfection and Mutagenesis of Target Genes in Mosquito Cells by Locked Nucleic Acid-modified Oligonucleotides. J. Vis. Exp. (46), e2355, doi:10.3791/2355 (2010).

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