SDS-PAGE/Immunoblot检测人脑皮层组织中的Aβ多聚匀浆使用抗原表位检索
Summary
我们描述了一个准备的人脑皮层匀浆澄清，经SDS – PAGE分离蛋白，抗原修复，并与Aβ肽抗体免疫印迹技术。使用这个协议，我们一贯检测皮层组织与阿尔茨海默氏症的病理的人类单体和多聚体的Aβ。
Abstract
异常折叠和聚合的β-淀粉样蛋白（Aβ）肽被认为是启动在阿尔茨海默氏病的发病机制的神经退行性级联<sup> 1</sup>。 Aβ的主要是40 – 42 – 氨基肽自聚集成β-片丰富的淀粉样蛋白在阿尔茨海默氏病的脑老年斑的核心发现纤维很容易。越来越多的证据表明，低分子量，可溶性Aβ多聚体超过纤维状的Aβ淀粉样蛋白的毒性<sup> 2</sup>。低和高的分子重量脑组织中的多聚体的Aβ物种的识别和量化，是一种在阿尔茨海默氏病研究的重要目标，还聘用的方法可以适用于其他proteopathies有毒的多聚体的识别和表征<sup> 3</sup>。自然发生的Aβ多聚体可以与Aβ的特异性抗体免疫SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。然而，多聚体的Aβ的分离和检测，需要高度集中的皮质匀浆和小孔径的硝酸纤维素膜抗原检索使用。在这里，我们描述为澄清人类皮质匀浆的技术准备，通过SDS – PAGE分离蛋白，抗原表位的检索/西方印迹抗体6E10Aβ肽的N -端区域。使用此协议，我们一贯检测Aβ的单体，二聚体，三聚体，四聚体，和更高的皮层组织中的分子量多聚体与阿尔茨海默氏症的病理的人类。
Protocol
Discussion
尽管Aβ聚集在阿尔茨海默氏病1,4,5的发病机制中的重要性，很少有研究描述或量化分配不同的Aβ多聚体在人脑皮层的组织样本2。常用的免疫组织化学技术不允许固定皮质组织中不同的多聚体的Aβ物种歧视。在不固定的皮质组织匀浆，Aβ的多聚体可以分离和生化评估使用凝胶电泳和抗体的检测方法。然而，有针对性的Aβ的抗原表位可能被隐藏在汇总和翻译后修饰的肽结构，防止聚集…
Acknowledgements
伊莱恩Pranski优秀的技术援助和卡罗琳Suwyn和哈里列文三，M.保罗墨菲，重要谈话和Marla杠杆许多感谢。 RR – 00165，PO1AG026423，P50AG025688，AG030539，伍德拉夫基金会和埃默里大学研究委员会提供了资金。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Santa Cruz Biotechnology | Sc-29130 | 1 tablet in 25ml buffer | |
| BCA Protein Assay kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | ||
| XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module Kit CE Mark | Invitrogen | EI0002 | ||
| Novex Tricine SDS Sample Buffer (2X) | Invitrogen | LC1676 | ||
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) | Invitrogen | NP0004 | ||
| SeeBlue Plus2 Pre-Stained Standard | Invitrogen | LC5925 | ||
| Novex 10-20% Tricine Gel 1.0 mm, 10 well | Invitrogen | EC6625BOX | ||
| Nitrocellulose membranes, 0.2 μm pore size | Invitrogen | LC2000 | ||
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10X) | Invitrogen | LC1675 | ||
| Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X) | Invitrogen | LC3675 | ||
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | Will not interfere with immunostaining | |
| ATX Ponceau S Red staining solution | Sigma Aldrich | 09276 | Will not interfere with immunostaining | |
| Kapak heat sealable plastic sample pouches | Fisher Scientific | 0181225AA | ||
| 6E10 mouse monoclonal antibody to Aβ(1-16) | Covance | SIG-39320 | Dilute 1:1,000 up to 1:5,000 for WB | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P2287 | ||
| ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Aβ (from sheep) | GE Healthcare Life Sciences | NA931-1ML | Dilute at 1:10,000 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | ThermoFisher | 34077 | ||
| Kodak Biomax MR Film | Carestream Health | 870 1302 |
References
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