ヒト皮質組織におけるAβ多量体のSDS-PAGE/Immunoblotの検出は、抗原エピトープの検索を使用してホモジネート
Summary
我々は明らかに人間の皮質ホモジネート、SDS – PAGEによるタンパク質の分離、抗原の検索とAβペプチドに対する抗体でイムノブロットを調製するためのテクニックを説明します。このプロトコルを使用して、我々は一貫してアルツハイマー病の病理と人間からの皮質組織で単量体と多量体Aβを検出する。
Abstract
β-アミロイドの異常折り畳み及び重合（Aβ）ペプチドは、アルツハイマー病の発症の神経変性カスケードを開始すると考えられている<sup> 1</sup>。アルツハイマー病の脳老人斑のコアに見られるβ-シートが豊富なアミロイド線維への自己凝集する傾向があるまたは42アミノ酸のペプチド – Aβは、主に40です。証拠を増やすと、その低分子量は、可溶性Aβの多量の線維Aβのアミロイドよりも毒性が示唆<sup> 2</sup>。脳組織における低および高分子量の多量のAβ種の同定と定量は、アルツハイマー病の研究に不可欠な目標である、とも用いられる方法は他のproteopathiesに有毒な多量体の同定と特性評価に適用することができます<sup> 3</sup>。天然由来のAβ多量体は、Aβ特異的抗体を用いたイムノブロッティングに続いてSDS -ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって検出することができます。しかし、多量Aβの分離と検出には小さいポアサイズのニトロセルロース膜に高濃度の皮質ホモジネートと抗原の検索を使用する必要があります。ここでは、明らかに人間の大脳皮質のホモジネート、SDS – PAGEによるタンパク質の分離、および抗原エピトープの検索/AβペプチドのN末端領域に対する抗体6E10とウェスタンブロッティングの準備のためのテクニックを説明します。このプロトコルを使用して、我々は一貫してアルツハイマー病の病理と人間からの皮質組織でAβモノマー、ダイマー、トリマー、テトラマー、およびより高い分子量のマルチマーを検出する。
Protocol
Discussion
アルツハイマー病1,4,5の病因におけるAβ凝集の重要性にもかかわらず、いくつかの研究ではヒト皮質組織試料2に、多様なAβ多量体の分布を説明したり、定量化している。一般的に使用される免疫組織化学法は、固定皮質組織内で個別の多量Aβの種の識別のために許可されていません。固定されていない皮質組織ホモジネートでは、Aβ多量体を分離し、生化学的にゲル電気泳動…
Acknowledgements
エレインPranskiと優秀な技術支援のためのキャロラインSuwynへとハリーレヴァインIII、M.ポールマーフィー、および重要な会話のためにギアリングマーラに感謝します。資金は、RR – 00165、PO1AG026423、P50AG025688、AG030539、ウッドラフ財団、エモリー大学研究委員会によって提供されていました。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Santa Cruz Biotechnology | Sc-29130 | 1 tablet in 25ml buffer | |
| BCA Protein Assay kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | ||
| XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module Kit CE Mark | Invitrogen | EI0002 | ||
| Novex Tricine SDS Sample Buffer (2X) | Invitrogen | LC1676 | ||
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) | Invitrogen | NP0004 | ||
| SeeBlue Plus2 Pre-Stained Standard | Invitrogen | LC5925 | ||
| Novex 10-20% Tricine Gel 1.0 mm, 10 well | Invitrogen | EC6625BOX | ||
| Nitrocellulose membranes, 0.2 μm pore size | Invitrogen | LC2000 | ||
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10X) | Invitrogen | LC1675 | ||
| Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X) | Invitrogen | LC3675 | ||
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | Will not interfere with immunostaining | |
| ATX Ponceau S Red staining solution | Sigma Aldrich | 09276 | Will not interfere with immunostaining | |
| Kapak heat sealable plastic sample pouches | Fisher Scientific | 0181225AA | ||
| 6E10 mouse monoclonal antibody to Aβ(1-16) | Covance | SIG-39320 | Dilute 1:1,000 up to 1:5,000 for WB | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P2287 | ||
| ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Aβ (from sheep) | GE Healthcare Life Sciences | NA931-1ML | Dilute at 1:10,000 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | ThermoFisher | 34077 | ||
| Kodak Biomax MR Film | Carestream Health | 870 1302 |
References
- Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297, 353-356 (2002).
- Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer’s amyloid beta-peptide. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 101-112 (2007).
- Walker, L. C., LeVine, H. The cerebral proteopathies. Neurobiol. Aging. 21, 559-561 (2000).
- Selkoe, D. J. Aging, amyloid, and Alzheimer’s disease: a perspective in honor. of Carl Cotman. Neurochem. Res. 28, 1705-1713 (2003).
- Walsh, D. M., Selkoe, D. J. Abeta oligomers – a decade of discovery. J. Neurochem. 101, 1172-1184 (2007).
- Swerdlow, P. S., Finley, D., Varshavsky, A. Enhancement of immunoblot sensitivity by heating of hydrated filters. Anal. Biochem. 156, 147-153 (1986).
- Ida, N., Hartmann, T., Pantel, J., Schröder, J., Zerfass, R., Förstl, H., Sandbrink, R., Masters, C. L., Beyreuther, K. Analysis of hetergeneous A4 peptides in human cerebrospinal fuid and blood by a newly developed sensitive Western blot assay. J. Biol. Chem. 271, 22908-22914 (1996).
