Summary

דגם Murine של הפעלת-CD40 בתאי B

Published: March 05, 2010
doi:

Summary

בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את התהליך של הפעלת-CD40 והרחבה של תאים B Murine מ splenocytes של C57BL / 6 עכברים, אשר יכול לשמש תא מודל אנטיגן מציג (APC) ללמוד אינדוקציה של חסינות.

Abstract

המחקר על תאים B הוכיחו כי CD40 ההפעלה משפר את יכולת הצגת האנטיגן שלהן. כאשר מגורה עם interleukin-4 ו CD40 ליגנד (CD40L), תאים B האדם ניתן להרחיב ללא קשיים של כמויות קטנות של דם היקפיים בתוך 14 ימים על כמויות גדולות מאוד של הפערים טהור CD40-B תאים (> 10<sup> 9</sup> התאים לחולה) מתורמים בריאים, כמו גם חולי סרטן<sup> 1-4</sup>. תאים CD40-B להביע חשוב הלימפה מולקולות ביות והוא יכול למשוך ותאי T<em> במבחנה</em<sup> 5</sup>. יתר על כן הם תופסים ביעילות, תהליך להציג אנטיגנים לתאי T<sup> 6,7</sup>. תאים CD40-B הוצגו נאיבי לא רק הממשלה, אלא גם להרחיב את הזיכרון T לתאים<sup> 8,9</sup>. לכן CD40 המופעל בתאי B (CD40-B תאים) נחקרו כמקור חלופי חיסונית של גירוי התאים המציגים אנטיגנים (APC) עבור מבוססי תאים immunotherapy1, 5,10. כדי ללמוד עוד אם התאים CD40-B לגרום האפקטיבית התגובות תא T in vivo ו ללמוד את המנגנון הבסיסי הקמנו מערכת תרבית תאים עבור הדור של CD40 המופעל בתאים Murine B. שימוש splenocytes או מטוהרים תאים B מעכברים C57BL / 6 להפעלה CD40, תנאים אופטימליים זוהו כדלקמן: החל מ splenocytes של C57BL / 6 עכברים (haplotype H-2B) לימפוציטים הם מטוהרים על ידי צנטריפוגה צפיפות שיפוע ושיתוף תרבותי עם הלה תאים להביע רקומביננטי Murine CD40 ליגנד (tmuCD40L הלה)<sup> 11</sup>. תאים הם recultured כל 3-4 ימים רכיבי מפתח כגון CD40L, interleukin-4, ו-Mercaptoethanol ציקלוספורין הם מתחדש. בפרוטוקול זה אנו מדגימים כיצד להשיג מופעל במלואו Murine CD40-B תאים (mCD40B) עם פנוטיפ דומה APC-CD40 ל-B תאים אנושיים (איור 1 א, ב). CD40-גירוי מוביל תולדה מהיר והרחבת טהורים ביותר (> 90%) CD19 + B תאים בתוך 14 ימים של תרבית תאים (איור 1 ג, ד). כדי למנוע זיהום עם הלא transfected תאים, ביטוי של ליגנד CD40 Murine על transfectants חייב להיות מבוקר באופן קבוע (איור 2). Murine CD40 המופעל בתאי B יכול לשמש כדי ללמוד B-cell הפעלה התמיינות, וכן לחקור את הפוטנציאל שלהם לתפקד APC במבחנה in vivo. יתר על כן, הם מייצגים כלי מבטיח עבור יצירת חיסון או טיפול מונע נגד גידולים יסייע לענות על שאלות לגבי בטיחות immunogenicity של גישה זו<sup> 12</sup>.

Protocol

פרוטוקול עבור הדור של CD40 המופעל בתאים Murine B (mCD40B) מ splenocytes מחולק לשני חלקים: חלק א 'מדגים את הכנת CD40 ליגנד Murine (CD40L) להביע תאים הלה (tmuCD40L הלה), אשר ישמש צלחת מחויב תאים מזין. חלק ב 'מתאר את התרבות בפועל Murine CD40-B. א הכנת תאים מזין (tmuCD40L הל…

Discussion

שינויים של פרוטוקול זה אפשרי, במיוחד לגבי מקורו של הגירוי-CD40 ואת סוג של זן העכבר משמש, גם מניב בדור יעילה של תאים Murine CD40-B מופעל. אחמדי et al. הראו תוצאות דומות עבור fibroblasts העכבר transfected עם Murine-CD40 ליגנד. במצגת זו בהקשר של אנטיגן קסנו ניתן לשלול בוודאות, אך מחקרים אינטנסיביים ?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מבקשים להודות לד"ר קלמנס Wendtner למתן tmuCD40-ליגנד, הלה קו התא.

Materials

A. Preparation of Media:

Feeder cell wild type medium Feeder cell selection medium  
Reagent Concentration Reagent Concentration
RPMI 1640   RPMI 1640  
L-Glutamine 300 μg/mL L-Glutamine 300 μg/mL
FBS 10 % FBS 10 %
HEPES 10 mM HEPES 10 mM
Gentamycin 15 μg/mL Gentamycin 15 μg/mL
   Hygromycin B 0.2 mg/mL
mCD40-B washing medium mCD40-B culture medium
Reagent Concentration Reagent Concentration
D-MEM
D-MEM
L-Glutamine 580 μg/mL L-Glutamine 580 μg/mL
Glucose 4.5 mg/mL Glucose 4.5 mg/mL
HEPES 10 mM HEPES 10 mM
Gentamycin 15 μg/mL Gentamycin 15 μg/mL


MEM 0.1mM (1x)


FBS 10%

B. Miscellaneous Reagents:

Reagent Company Order No
RPMI 1640 Invitrogen Gibco® REF 21875
D-MEM Invitrogen Gibco® REF 41965
Dulbecco´s PBS (10x) PAA Cat No H15-011
Gencin® Delta Select Art No 7395800
FBS LONZA Cat No DE14-802C
HEPES Buffer PAA Cat No S11-001
MEM NEAA Invitrogen Gibco® REF 11140
Hygromycin B PAA Cat No P02-015
Recombinant Murine Interleukin-4 Immunotools Cat No 12340045
Cyclosporin A Novartis Cat No NDC 0078-0109-01
Trypsin/EDTA (10x) Invitrogen Gibco® REF 15400-054

C. Miscellaneous Supplies:

Reagent Company Order No
Sterile pipette tips Sarstedt  
6-well plate NUNC Cat No 140675
50mL conical tube BD Falcon™ Cat No 352070
Tissue culture flask Sarstedt Cat No 83.1813.002

References

  1. Schultze, J. L. CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy. J Clin Invest. 100 (11), 2757-2765 (1997).
  2. Wiesner, M. Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation. PLoS ONE. 3, e1464-e1464 (2008).
  3. Kondo, E. Efficient generation of antigen-specific cytotoxic T cells using retrovirally transduced CD40-activated B cells. J Immunol. 169 (4), 2164-2171 (2002).
  4. Liebig, T. M., Fiedler, A., Zoghi, S., Shimabukuro-Vornhagen, A., Bergwelt-Baildon, M. S. Generation of human CD40-activated B cells. J Vis Exp. 32, (2009).
  5. von Bergwelt-Baildon, M. CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants. Blood. 107 (7), 2786-2789 (2006).
  6. Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells. Cancer Res. 63 (11), 2836-2843 (2003).
  7. Ahmadi, T., Flies, A., Efebera, Y., Sherr, D. H. CD40 Ligand-activated, antigen-specific B cells are comparable to mature dendritic cells in presenting protein antigens and major histocompatibility complex class I- and class II-binding peptides. Immunology. 124 (1), 129-140 (2008).
  8. Bergwelt-Baildon, M. S. v. o. n. Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application. Blood. 99 (9), 3319-3325 (2002).
  9. Kondo, E. CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential. Clin Exp Immunol. 155 (2), 249-256 (2009).
  10. Schultze, J. L., Grabbe, S., von Bergwelt-Baildon, M. S. DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy. Trends Immunol. 25 (12), 659-664 (2004).
  11. Mayr, C. Chromosomal translocations are associated with poor prognosis in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 107 (2), 742-751 (2006).
  12. Mason, N. J. RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma. Gene Ther. 15 (13), 955-965 (2008).

Play Video

Citer Cet Article
Liebig, T. M., Fiedler, A., Klein-Gonzalez, N., Shimabukuro-Vornhagen, A., von Bergwelt-Baildon, M. Murine Model of CD40-activation of B cells. J. Vis. Exp. (37), e1734, doi:10.3791/1734 (2010).

View Video