Zebrafish 상악 바벌의 연구 방법

Zebrafish 축산 Zebrafish는 표준 방법 1에 따라 위치해와 reared 수 있습니다. 후반 애벌레 기간 과거 zebrafish의 발달 단계는 꼬리 지느러미 (posteriormost hypural 판)의 기지로 윗입술의 anteriormost 시점에서 자사의 표준 길이 (SL) 또는 밀리미터에서 직선 거리로 측정할 수 2. 약 개월 게시물 수정 (10-12밀리미터 SL)에서, 비강과 상악 동의 barbels는 각각의 후각 구덩이 근처와 maxillae의 뒷부분 모서리 등 투명 상피 봉오리를 나타납니다. zebrafish가 성숙으로, barbels가 좁은, 수염 같은 부속으로 연장. 상악 바벌가 큰 (2-3 ㎜)과 조작하기 쉬운이기 때문에, 우리의 프로토콜에만이 특정 부위요 적용, 유사한 기술, 그러나, 작은 코와 수염 적응 수 있습니다. 바벌 클리핑 시스템 물에 산도 7.0에 버퍼 (에틸 3 aminobenzoate methanesulfonate) 0.015 % MS – 222에 침수하여 원하는 단계 (예., 1.5-2.5 cm SL ~ 3~6개월 포스트 – 수정)에서 성인 zebrafish을 마취시키다. 수영 동작 그만 때까지 관찰하고 길 환기가 느린 일반됩니다. 물고기의 크기에 따라 완료 마취 약 2~5분 걸립니다. 수족관 엄마랑 사용하여 배양 접시에있는 서부 유럽 표준시 종이 타월에 접혀 조각 한 번에 1-3 물고기를 전송합니다. 무딘 주걱을 사용하여, 동양 그들이 서로 왼쪽 측면쪽으로 평행하게되도록 물고기. 절차를 수행하는 동안 피부와 아가미가 촉촉한 유지까지 operculum으로 몸 전체를 덮고 물고기 (길도 포함)의 꼬리 부분에 젖은 종이 타월을 접어 부분입니다. 머리 지역을 밝히는 낮은 앵글 입사 광을 사용하여 stereomicroscope 아래의 페트리 접시를 볼 수 있습니다. maxilla의 사후 복부 코너 (그림 1)에서 protrudes 왼쪽 턱의 수염의 기본에 중점을두고 있습니다. 그림 1. 단단히 maxilla의 가장자리에 약간 말초 바벌의 샤프트를 파악. 바벌 샤프트를 강화하고 포셉 단 근위 미세 밀고 스프링 가위의 문턱을 삽입합니다. 가위는 안정 포셉에 감동하실 수 있습니다. 최첨단의 maxilla의 가장자리에 도달 때까지 바벌의 축을 따라 가위의 문턱을 슬라이드. 바벌 샤프트 잘리는 가위를 닫습니다. 절단 바벌, 아직까지 포셉에 사로잡혔다는 고정 또는 추가 관찰을 위해 제거할 수 있습니다. 즉시 표면 곰팡이 감염을 제어하는​​ 파란색 메틸렌 한 방울을 포함하는 청소 시스템 물 (~ 500 ML)의 작은 수조에 물고기를 전송합니다. 물고기가 하루 복구할 수 있습니다. 다음날 아침, 양육 시스템에 물고기를 반환합니다. 바벌 재생 2 주 후에 최대한입니다. 일치하는 바벌의 쌍을 아가르 퍼가기 적절한 안락사 기술로 물고기를 모아 4 ° C에서 밤새 교반과 호수 (PBS)를 버퍼 4퍼센트 50 ML 튜브 paraformaldehyde – 인산염의 수정. 정착액 볼륨은 조직의 최소 10 배 볼륨해야합니다. 고정 후, 승인된 용기에 paraformaldehyde 폐기물의 처분과 PBS의 여러 변화에 철저하게 조직을 씻어. 2 % 250 ML 유리 플라스크 150 ML에서 준비 아가로 오스 (T M ~ 37 ° C) 증류수 인치 완전히 녹아까지 전자 레인지 또는 뜨거운 접시와 열, 주기적으로 agitating. 50-60 ° C의 물을 욕조에 녹은 솔루션을 평형. 단단히 버퍼 챔버의 측면에 대해, 작은 gasketed 젤 곰팡이 (~ 100 ML 젤 볼륨 10 × 10cm) 배치하여 표준 젤 전기 영동 장비를 조립. 2-4 작은 이빨 샘플 빗 (4 X 1.5 mm)을 추가합니다. 수준의 표면에 아주 얕은 우물을 형성 빗의 기반을 커버 그냥 금형에 녹아 아가로 오스를 부어. 즉시 온수 욕조에 다시 남은 아가로 오스를 넣어, 이것은 조직을 (9-12 단계) 포함 나중에 사용됩니다. 아가로 오스와 같은 온도로 피펫을 유지 술병에 긴 유리 파스퇴르 피펫 놔. 20-30분에 대한 강화로 젤을 허용합니다. 빗를 제거한 후 버퍼 챔버에서 강화된 젤이 들어있는 겔 곰팡이를 제거합니다. 겔가 슬라이드되지 않도록 단단히 실험실 테이프로 겔 금형의 열린 측면을 테이프. 추가 아가로 오스가 (단계 13) 나중에 추가될 수 있도록이 테이프는 아가로 오스의 표면 여러 mm를 확장해야합니다. stereomicroscope의 무대에 겔 금형을 놓습니다. 빈 우물을 확대하고 초점에 가장자리를 가져. 잘 인접 아가로 오스의 표면에, 물 또는 고정 바벌의 표본 (예, 재생 및 제어)가 포함된 버퍼의 드롭을 피펫. UsiNG는 잘으로 촉촉한 표본을 드래그하여 아래로 밀어, 곤충 핀을 구부 러. 동양 바벌 샤프트의 서로 평행하고 잘의 반대 긴 가장자리에 대한 정렬. 표면 장력 위치에서 조직을 보유 도움이 될 것입니다. 언제 포함 준비, 훌륭한 피펫 팁 또는 우물에서 여분 액체를 제거하는 실험실 조직의 모서리를 사용합니다. 조직가 건조하게하지 빨리 이렇게 작동합니다. 예열 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 부드럽게 장소에서 바벌 조직을 봉인하기 위해 표본과 주변의 신선한 녹은 아가로 오스를 피펫. 너무 많이 넣다하지 마십시오. 아가로 오스는 견고하게하기 전에, 곤충 핀 지난 분을 조정합니다. 잘 옆의 숫자 종이 표본 레이블을 장소와 아가로 오스의 작은 방울로를 확보. 반복 표본의 각 잘 10을 통해 6 단계를 반복합니다. 이미지 보정을위한 원하는 경우, 인쇄 마이크로 미터 규모 (예, 함께 종이를 삽입 http://incompetech.com/graphpaper/multiwidth/ 잘 빈의 맨 아래에). 우물의 바닥에 종이를 평평하게하고 따뜻한 아가로 오스로 커버. 표본 모두 포함된 후, 젤의 표면은 아가로 오스의 경화 방울과 함께 불규칙한 것입니다. 평평한 표면에 젤을 놓고 상부 표면이 균일 때까지 부드럽게 녹아 추가 아가로 오스에 부어. 부드러운 표면을 얻기 위해 필요한 아가로 오스의 가장 작은 양을 사용하고 너무 아가로 오스는 전송 – 가벼운 사진을 흐릿하게 것입니다. 하든이 상위 계층을 허용합니다. 젤 이제 각 바벌 쌍을위한 총 형태를 기록 stereomicroscope의 무대 사진 수 있습니다. 이미지 보정은 임베디드 마이크로 미터 규모를 사진 촬영하여 얻을 수 있습니다. 전체 젤은 서부 유럽 표준시 종이 타올에 싸여 몇 주 동안 4 명이 한 비닐 봉투에 봉인 저장할 수 있습니다. 자세한 분석을 위해, barbels의 일치하는 쌍을 포함하는 한천 블록은 메스 또는 레이저 블레이드로 젤 도려낸 수 있으며, 파라핀의 조직학에 대한 처리 또는 표준 방법에 의해 3,4 cryosectioning. 또는 개인 barbels는 물에 씻어서 잘 바늘과 아가로 오스 밖 해부 및 기타 다운 스트림 응용 프로그램 (예 : 전체 마운트 immunohistochemistry 또는 공촛점 현미경)을 처리할 수 있습니다.