Utilisation d’un test de décalage thermique pour sonder la liaison du substrat à la sélénoprotéine O

Une grande partie du protéome humain reste mal caractérisée. L’« effet de lumière publique » décrit par Dunham et Kustatscher et al. fait référence au phénomène où les protéines largement étudiées reçoivent plus d’attention, laissant les protéines sous-étudiées négligées ^1,2. Les facteurs contribuant à cet effet comprennent l’importance biologique et la pertinence de certaines protéines pour la maladie. De plus, les recherches antérieures qui offrent des connaissances fondamentales, ainsi que la disponibilité d’outils pour l’analyse fonctionnelle, stimulent davantage la recherche sur les protéines ^1,2 très étudiées. Des projets tels que l’Initiative sur les protéines sous-étudiées, le Consortium en génomique structurale et l’Initiative sur la fonction enzymatique visent à caractériser les protéines sous-étudiées à l’aide de la protéomique structurale et fonctionnelle ^2,3,4. Une approche complémentaire pour identifier les fonctions moléculaires des protéines sous-étudiées consiste à examiner les interactions de ces protéines avec de petites molécules afin d’obtenir des informations précieuses sur la régulation et la spécificité du substrat.

La liaison de petites molécules peut augmenter la stabilité thermique d’une protéine⁵. Ce phénomène, connu sous le nom de stabilisation de conformation induite par le ligand, entraîne souvent une augmentation de la température de fusion d’une protéine, fournissant une indication mesurable de la liaison du ligand⁶. La stabilité thermique d’une protéine peut être mesurée à l’aide de la fluorimétrie différentielle à balayage (DSF), également connue sous le nom de thermofluor, ou du test de décalage thermique (TSA)7,8,9,10. Dans la TSA, un échantillon de protéine est soumis à des températures croissantes en présence d’un colorant sensible à l’environnement⁶. Au fur et à mesure que la protéine se déploie et se dénature, le colorant se lie aux régions hydrophobes exposées de la protéine et émet une fluorescence. Les colorants fluorescents extrinsèques, ou colorants sensibles à l’environnement, n’ont pas de fluorescence intrinsèque et deviennent fluorescents lors de l’interaction avec leur molécule cible ^9,11,12. Le colorant le plus couramment utilisé, SYPRO Orange, offre plusieurs avantages tels qu’une stabilité accrue et une fluorescence de fond minimale ^8,9,12. Notamment, SYPRO Orange est compatible avec les systèmes de réaction en chaîne par polymérase en temps réel (RT-PCR) compte tenu de ses longueurs d’onde d’excitation et d’émission d’environ 470 nm et 570 nm, respectivement. Cette caractéristique unique permet d’obtenir des mesures à haut débit, précises et sensibles, compatibles avec les systèmes de détection de fluorescence couramment utilisés dans les systèmes RT-PCR⁸.

La TSA est un outil polyvalent pour étudier les interactions des protéines avec des cofacteurs ou des médicaments potentiels et pour identifier les conditions stabilisatrices de la cristallographie. Certains de ses avantages par rapport aux autres méthodes de criblage sont sa relative simplicité de configuration et son débit élevé avec des plaques de 96 ou 384 puits 13,14,15. Le développement de cette technique a transformé les études de découverte de médicaments, offrant une commodité et permettant l’étude de divers additifs tels que les ions, les ligands et les médicaments ^6,16. De plus, l’adaptabilité de la TSA a encouragé les scientifiques à étendre son utilité, facilitant la mesure des affinités de liaison parallèlement aux tests de dépistage^17,18. La TSA est un outil efficace dans les études de biologie structurale pour identifier les conditions qui favorisent la stabilisation de la protéine d’intérêt pour la cristallisation¹⁹. Ainsi, sa flexibilité et sa relative facilité ont positionné la TSA comme une technique fondamentale dans la caractérisation des protéines. Ici, nous utiliserons la TSA pour analyser la liaison des métaux et des nucléotides à la pseudokinase sous-étudiée, la sélénoprotéine O (SelO), à titre d’exemple.

Les kinases sont l’une des familles de protéines les plus ciblées dans la découverte de médicaments²⁰. Environ 10 % des kinases humaines sont prédites comme étant inactives et appelées pseudokinases parce qu’elles manquent de résidus catalytiques clés nécessaires à la catalyse^21,22. La sélénoprotéine O (SelO) est une pseudokinase conservée au cours de l’évolution qui n’a pas l’aspartate conservé dans le motif catalytique HRD²³. Chez les eucaryotes, SelO se localise dans les mitochondries et protège les cellules du stress oxydatif^24,25. Les analyses structurales et biochimiques montrent que SelO transfère l’adénosine monophosphate (AMP) de l’ATP aux substrats protéiques dans une modification post-traductionnelle connue sous le nom d’AMPylation²⁵. Des études récentes indiquent que les enzymes qui catalysent l’AMPylation peuvent se lier à d’autres nucléotides tels que l’UTP in vitro ^26,27. Notamment, des études ont démontré que l’homologue SelO de Salmonella typhimurium catalyse la protéine UMPylation, ou le transfert d’UMP, de manière dépendante du manganèse²⁸. Compte tenu de ces observations intrigantes, nous testons la liaison de SelO à l’ATP et à l’UTP en présence de magnésium et de manganèse, servant d’exemple représentatif des applications de la TSA. Le protocole suivant peut être facilement adapté pour optimiser et examiner les interactions d’autres protéines et additifs d’intérêt.