Zugang zur frühen Differenzierung der virusspezifischen follikulären Helferzelle CD4+ T-Zellen in akuten LCMV-infizierten Mäusen
Summary
Die aktuelle Studie zeigt Protokolle zur Bewertung der frühen Schicksalsbindung von virusspezifischenT-FH-Zellen und zur Manipulation der Genexpression in diesen Zellen.
Abstract
Follikuläre T-Helferzellen (TFH) werden als eigenständige CD4+ T-Zelllinie wahrgenommen, die verwandte B-Zellen bei der Produktion von hochaffinen Antikörpern unterstützt und so eine langfristige humorale Immunität aufbaut. Während einer akuten Virusinfektion wird das Schicksal virusspezifischerT-FH-Zellen in der frühen Infektionsphase bestimmt, und Untersuchungen der früh differenziertenT-FH-Zellen sind entscheidend für das Verständnis der T-Zell-abhängigen humoralen Immunität und die Optimierung des Impfstoffdesigns. In der Studie haben wir unter Verwendung eines Mausmodells für eine akute Infektion mit dem lymphozytären Choriomeningitis-Virus (LCMV) und der TCR-transgenen SMARTA (SM)-Maus mit CD4+ T-Zellen, die spezifisch das LCMV-Glykoprotein-Epitop I-AbGP66-77 erkennen, Verfahren beschrieben, um auf der Grundlage von Durchflusszytometrie-Färbungen auf das frühe Schicksal von virusspezifischenT-FH-Zellen zuzugreifen. Darüber hinaus werden durch die Ausnutzung der retroviralen Transduktion von SM CD4+ T-Zellen auch Methoden zur Manipulation der Genexpression in früh differenzierten virusspezifischenT-FH-Zellen bereitgestellt. Daher werden diese Methoden bei Studien helfen, die den Mechanismus untersuchen, der der frühen Bindung von virusspezifischenT-FH-Zellen zugrunde liegt.
Introduction
Wenn naive CD4+ T-Zellen auf unterschiedliche Krankheitserreger oder Bedrohungen treffen, passen sie ihre Immunantworten an, indem sie sich in verschiedene T-Helfer-Zell-Untergruppen (TH) mit spezialisierten Funktionen differenzieren1. Im Szenario einer akuten Virusinfektion differenziert sich ein großer Teil der naiven CD4+ T-Zellen zu follikulären Helfer-T (TFH)-Zellen, die den B-Zellen helfen 2,3. Im Unterschied zu anderen CD4+ TH Zell-Untergruppen (z. B. TH1, TH2, TH9 und TH17 Zellen) exprimieren TFH-Zellen eine beträchtliche Menge an CXCR5, dem Chemokinrezeptor für das B-Zell-Homing-Chemokin CXCL13, das es TFH-Zellen ermöglicht, in B-Zellfollikel zu wandern. In den B-Zell-Follikeln unterstützenT-FH-Zellen verwandte B-Zellen bei der Initiierung und Aufrechterhaltung von Keimzentrumsreaktionen und ermöglichen so eine schnelle Produktion von Antikörpern mit hoher Affinität und ein humorales Langzeitgedächtnis 2,3.
Nach einer akuten Virusinfektion erfolgt die frühe Schicksalsbindung von virusspezifischenT-FH-Zellen innerhalb von 72 h 4,5 und wird durch den transkriptionellen Repressor B-Zell-Lymphom-6 (Bcl-6)5,6,7,8 gesteuert, der als “Master-Regulator” fungiert und über das Schicksal vonT-FH-Zellen entscheidet. Ein Mangel an Bcl-6 stumpft die Differenzierung derT-FH-Zellen stark ab, während die ektopische Bcl-6-Expression die Bindung der T-FH-Zellen an das Schicksal derT-FH-Zellen erheblich fördert. Zusätzlich zu Bcl-6 sind mehrere Moleküle an der Instruktion des frühen Schicksals derT-FH-Zellen beteiligt. Die Transkriptionsfaktoren TCF-1 und LEF-1 initiieren die Differenzierung derT-FH-Zellen über die Induktion von Bcl-6 9,10,11. Die Hemmung von Blimp1 sowohl durch Bcl-6 als auch durch TCF-1 ist für die frühe Bindung vonT-FH-Zellen erforderlich11,12. STAT1 und STAT3 werden auch für die frühe Differenzierung vonT-FH-Zellen benötigt13. Darüber hinaus tragen epigenetische Modifikationen durch die Histon-Methyltransferase EZH214,15 und die m6A-Methyltransferase METTL316 dazu bei, die Transkriptionsprogramme derT-FH-Zellen (insbesondere Bcl6 und Tcf7) zu stabilisieren und damit das frühe Schicksal derT-FH-Zellen zu unterstützen. Während Fortschritte, einschließlich der oben genannten Moleküle und anderer, die an anderer Stellezusammengefasst sind 3, beim Verständnis der transkriptionellen und epigenetischen Regulation des frühen Schicksals vonT-FH-Zellen gemacht wurden, müssen bisher unbekannte Moleküle noch gelernt werden.
Im Mausmodell der akuten lymphozytären Choriomeningitis-Virus (LCMV)-Infektion durchlaufen adoptiv übertragene kongene TCR-transgene SMARTA (SM) CD4+ T-Zellen, die spezifisch das LCMV-Glykoprotein-Epitop I-AbGP66-77 erkennen, während der Virusinfektion entweder eineT-FH– oder eineT-H1-Zelldifferenzierung. Dieses TFH/TH1-Bifurkationsdifferenzierungsmuster unterstützt die Weiterentwicklung des SM/akuten LCMV-Infektionsmodells bei der Untersuchung der Biologie virusspezifischer TFH-Zellen. In der Tat ist das SM/akute LCMV-Infektionsmodell in derT-FH-Zellforschung weit verbreitet und hat eine entscheidende Rolle bei bahnbrechenden Entdeckungen in derT-FH-Zellbiologie gespielt. Dies beinhaltet die Identifizierung des bereits erwähnten Bcl-6 als liniendefinierenden Transkriptionsfaktor derT-FH-Zellen 5,6 sowie anderer wichtiger transkriptioneller Faktoren (z. B. Blimp-16, TCF-1/LEF 9,10,11, STAT1/STAT313, STAT517, KLF218 und Itch19), die die Differenzierungvon T-FH-Zellen steuern, posttranskriptionelle Regulierungen ( z.B. METTL316 und miR-17~9220) der T-FH-Zelldifferenzierung, des T-FH-Zellgedächtnisses und der Plastizität21,22 und rationaler Impfstrategien, die auf T-FH-Zellen abzielen (z. B. Selen23).
Die vorliegende Studie beschreibt reproduzierbare Methoden für den Zugang zur frühen Schicksalsbindung von virusspezifischenT-FH-Zellen , einschließlich (1) der Etablierung eines akuten LCMV-infizierten SM-Chimären-Mausmodells, das für den Zugang zu früh differenziertenT-FH-Zellen geeignet ist, (2) der Durchführung von Durchflusszytometrie-Färbungen von Molekülen, die mit frühdifferenziertenT-FH-Zellen verwandt sind, und (3) der Durchführung retroviraler vektorbasierter Genmanipulation in SM CD4+ T-Zellen. Diese Methoden werden für Studien nützlich sein, die die frühe Schicksalsbindung von virusspezifischenT-FH-Zellen untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Forschung auf dem Gebiet derT-FH-Zellen ist seit der Entdeckung der spezialisierten Funktion vonT-FH-Zellen bei der Unterstützung von B-Zellen hervorgehoben worden. Häufende Studien deuteten darauf hin, dass dieT-FH-Zelldifferenzierung ein mehrstufiger und multifaktorieller Prozess30 ist, wobei die Schicksalsbindung derT-FH-Zellen im frühen Stadium bestimmt wird5. Daher ist ein besseres Verständnis der Mechanismen, die fr?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (Nr. 32300785 bis X.C.), des China National Postdoctoral Program for Innovative Talents (Nr. BX20230449 bis X.C.) und das National Science and Technology Major Project (Nr. 2021YFC2300602 bis L.Y.).
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Corning | 25-052-CI | |
| 4% Paraformaldehyde Fix Solution, 4% PFA | Beyotime | P0099-500mL | |
| 70 μm cell strainer | Merck | CLS431751 | |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse TCR Vα2 (clone B20.1) | Biolegend | 127812 | 1:200 dilution |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.1 (clone A20) | Biolegend | 110724 | 1:200 dilution |
| APC anti-mouse CD25 (clone PC61) | Biolegend | 101910 | 1:200 dilution |
| B6 CD45.1 (B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ) mouse | The Jackson Laboratory | 002014 | |
| BeaverBeads Streptavidin | Beaver | 22321-10 | |
| Biotin anti-mouse F4/80 Antibody (clone BM8) | Biolegend | 123106 | 1:200 dilution |
| Biotin Rat anti-mouse CD11c (clone N418) | Biolegend | 117304 | 1:200 dilution |
| Biotin Rat anti-Mouse CD19 (clone 6D5) | Biolegend | 115504 | 1:200 dilution |
| Biotin Rat anti-Mouse CD8a (clone 53-6.7) | Biolegend | 100704 | 1:200 dilution |
| Biotin Rat anti-mouse NK-1.1 (clone PK136) | Biolegend | 108704 | 1:200 dilution |
| Biotin Rat anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (clone TER-119) | Biolegend | 116204 | 1:200 dilution |
| bovine serum albumin, BSA | Sigma | A7906 | |
| Brilliant Violet 421 anti-T-bet (clone 4B10) | Biolegend | 644816 | 1:100 dilution |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD279 (PD-1) (clone 29F.1A12) | Biolegend | 135220 | 1:200 dilution |
| C57BL/6J (B6) mouse | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| CXCR5-GFP knock-in reporter mouse | In house; the CXCR5-GFP knock-in mouse line was generated by the insertion of an IRES-GFP construct after the open reading frame of Cxcr5. | ||
| DMEM 10% medium | DMEM medium containing 10% FBS | ||
| DMEM medium | Gibco | 11885092 | |
| EDTA | Sigma | E9884 | |
| FACSFortesa | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine serum, FBS | Sigma | F8318 | |
| FlowJo (version 10.4.0) | BD Biosciences | ||
| Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | Invitrogen | 00-5523-00 | The kit contains three reagents: a. Fixation/Permeabilization Concentrate (4X); b. Fixation / Permeabilization Diluent; c. Permeabilization Buffer. |
| Goat Anti-Rat IgG Antibody (H+L), Biotinylated | Vector laboratories | BA-9400-1.5 | 1:200 dilution |
| Invitrogen EVOS FL Auto Cell Imaging System | ThermoFisher Scientific | ||
| Isolation buffer | FACS buffer containing 0.5% BSA and 2mM EDTA | ||
| LCMV GP61-77 peptide (GLKGPDIYKGVYQFKSV) | Chinese Peptide Company | ||
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | 1:200 dilution |
| MigR1 | addgene | #27490 | |
| NaN3 | Sigma | S2002 | |
| Opti-MEM medium | Gibco | 31985070 | |
| pCL-Eco | addgene | #12371 | |
| PE anti-mouse CD69 (clone H1.2F3) | Biolegend | 104508 | 1:200 dilution |
| PE Mouse anti-Bcl-6 (clone K112-91) | BD Biosciences | 561522 | 1:50 dilution |
| Phosphate buffered saline, PBS | Gibco | 10010072 | |
| Polybrene | Solarbio | H8761 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CXCR5 (clone 2G8) | BD Biosciences | 551961 | 1:50 dilution |
| Rat monoclonal PerCP anti-mouse CD4 (clone RM4-5) | Biolegend | 100538 | 1:200 dilution |
| recombinant murine IL-2 | Gibco | 212-12-1MG | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Beyotime | C3702-500mL | |
| RPMI 1640 medium | Sigma | R8758 | |
| RPMI 2% | RPMI 1640 medium containing 2% FBS | ||
| SMARTA (SM) TCR transgenic mouse | SM TCR transgenic line in our lab is a gift from Dr. Rafi Ahmed (Emory University). Additionally, this mouse line can also be obtained from The Jackson Laboratory (stain#: 030450). | ||
| Staining buffer | PBS containing 2% FBS and 0.01% NaN3 | ||
| Streptavidin PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4317-82 | 1:200 dilution |
| TCF1/TCF7 (C63D9) Rabbit mAb (Alexa Fluor 488 Conjugate) | Cell signaling technology | 6444S | 1:400 dilution |
| TFH cell staining buffer | FACS buffer containing 1% BSA and 2% mouse serum | ||
| TransIT-293 reagent | Mirus Bio | MIRUMIR2700 |
Referencias
- O’shea, J. J., Paul, W. E. Mechanisms underlying lineage commitment and plasticity of helper CD4+ T cells. Science. 327 (5969), 1098-1102 (2010).
- Crotty, S. T follicular helper cell biology: A decade of discovery and diseases. Immunity. 50 (5), 1132-1148 (2019).
- Vinuesa, C. G., Linterman, M. A., Yu, D., Maclennan, I. C. Follicular helper t cells. Annu Rev Immunol. 34, 335-368 (2016).
- Choi, Y. S., et al. ICOS receptor instructs T follicular helper cell versus effector cell differentiation via induction of the transcriptional repressor bcl6. Immunity. 34 (6), 932-946 (2011).
- Choi, Y. S., et al. Bcl6 expressing follicular helper CD4 T cells are fate committed early and have the capacity to form memory. J Immunol. 190 (8), 4014-4026 (2013).
- Johnston, R. J., et al. Bcl6 and BLIMP-1 are reciprocal and antagonistic regulators of T follicular helper cell differentiation. Science. 325 (5943), 1006-1010 (2009).
- Nurieva, R. I., et al. Bcl6 mediates the development of T follicular helper cells. Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).
- Yu, D., et al. The transcriptional repressor bcl-6 directs T follicular helper cell lineage commitment. Immunity. 31 (3), 457-468 (2009).
- Choi, Y. S., et al. LEF1 and TCF1 orchestrate T(FH) differentiation by regulating differentiation circuits upstream of the transcriptional repressor bcl6. Nat Immunol. 16 (9), 980-990 (2015).
- Wu, T., et al. TCF1 is required for the t follicular helper cell response to viral infection. Cell Rep. 12 (12), 2099-2110 (2015).
- Xu, L., et al. The transcription factor TCF-1 initiates the differentiation of T(FH) cells during acute viral infection. Nat Immunol. 16 (9), 991-999 (2015).
- Oestreich, K. J., Mohn, S. E., Weinmann, A. S. Molecular mechanisms that control the expression and activity of bcl-6 in th1 cells to regulate flexibility with a TFH-like gene profile. Nat Immunol. 13 (4), 405-411 (2012).
- Choi, Y. S., Eto, D., Yang, J. A., Lao, C., Crotty, S. Cutting edge: STAT1 is required for IL-6-mediated bcl6 induction for early follicular helper cell differentiation. J Immunol. 190 (7), 3049-3053 (2013).
- Chen, X., et al. The histone methyltransferase ezh2 primes the early differentiation of follicular helper T cells during acute viral infection. Cell Mol Immunol. 17 (3), 247-260 (2020).
- Li, F., et al. Ezh2 programs T(FH) differentiation by integrating phosphorylation-dependent activation of bcl6 and polycomb-dependent repression of p19ARF. Nat Commun. 9 (1), 5452 (2018).
- Yao, Y., et al. METTL3-dependent m(6)A modification programs T follicular helper cell differentiation. Nat Commun. 12 (1), 1333 (2021).
- Johnston, R. J., Choi, Y. S., Diamond, J., Yang, J. A., Crotty, S. STAT5 is a potent negative regulator of TFH cell differentiation. J Exp Med. 209 (2), 243-250 (2012).
- Lee, J. Y., et al. The transcription factor KLF2 restrains CD4+ T follicular helper cell differentiation. Immunity. 42 (2), 252-264 (2015).
- Xiao, N., et al. The e3 ubiquitin ligase itch is required for the differentiation of follicular helper t cells. Nat Immunol. 15 (7), 657-666 (2014).
- Baumjohann, D., et al. The microRNA cluster mir-17~92 promotes TFH cell differentiation and represses subset-inappropriate gene expression. Nat Immunol. 14 (8), 840-848 (2013).
- Wang, Y., et al. The kinase complex mTORC2 promotes the longevity of virus-specific memory CD4(+) T cells by preventing ferroptosis. Nat Immunol. 23 (2), 303-317 (2022).
- Hale, J. S., et al. Distinct memory CD4+ T cells with commitment to T follicular helper- and T helper 1-cell lineages are generated after acute viral infection. Immunity. 38 (4), 805-817 (2013).
- Yao, Y., et al. Selenium-GPX4 axis protects follicular helper t cells from ferroptosis. Nat Immunol. 22 (9), 1127-1139 (2021).
- Oxenius, A., Bachmann, M. F., Zinkernagel, R. M., Hengartner, H. Virus-specific MHC-class II-restricted TCR-transgenic mice: Effects on humoral and cellular immune responses after viral infection. Eur J Immunol. 28 (1), 390-400 (1998).
- Grosjean, C., et al. Isolation and enrichment of mouse splenic t cells for ex vivo and in vivo T cell receptor stimulation assays. STAR Protoc. 2 (4), 100961 (2021).
- Dowling, P., et al. Protocol for the bottom-up proteomic analysis of mouse spleen. STAR Protoc. 1 (3), 100196 (2020).
- Choi, Y. S., Crotty, S. Retroviral vector expression in TCR transgenic CD4+ T cells. Methods Mol Biol. 1291, 49-61 (2015).
- Wu, D., et al. A method for expansion and retroviral transduction of mouse regulatory T cells. J Immunol Methods. 488, 112931 (2021).
- He, R., et al. Follicular CXCR5- expressing CD8(+) T cells curtail chronic viral infection. Nature. 537 (7620), 412-428 (2016).
- Crotty, S. Follicular helper CD4 T cells (TFH). Annu Rev Immunol. 29, 621-663 (2011).
- Breitfeld, D., et al. Follicular B helper T cells express CXC chemokine receptor 5, localize to B cell follicles, and support immunoglobulin production. J Exp Med. 192 (11), 1545-1552 (2000).
- Xu, L., et al. The kinase mTORC1 promotes the generation and suppressive function of follicular regulatory t cells. Immunity. 47 (3), 538-551 (2017).
- Chen, X., et al. The phosphatase pten links platelets with immune regulatory functions of mouse T follicular helper cells. Nat Commun. 13 (1), 2762 (2022).
- Chen, J. S., et al. Flow cytometric identification of T(fh)13 cells in mouse and human. J Allergy Clin Immunol. 147 (2), 470-483 (2021).
