JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Traducción Automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Inmunología y contagio

גישה להבחנה מוקדמת של תאי T CD4+ עוזר זקיקים ספציפי לווירוס בעכברים נגועים ב- LCMV חריף

Published: April 26, 2024
doi:
10.3791/66752
, , , , , ,
1Department of Urology, South China Hospital, Medical School,Shenzhen University, 2Guangdong Key Laboratory for Biomedical Measurements and Ultrasound Imaging, National-Regional Key Technology Engineering Laboratory for Medical Ultrasound, School of Biomedical Engineering,Shenzhen University Medical School, 3Cancer Center, Daping Hospital & Army Medical Center of PLA,Third Military Medical University, 4Guangdong Provincial Key Laboratory of Immune Regulation and Immunotherapy, School of Laboratory Medicine and Biotechnology,Southern Medical University, 5Institute of Immunology,Third Military Medical University, 6Dermatology Hospital,Southern Medical University, 7Institute of Immunological Innovation and Translation,Chongqing Medical University

Summary

המחקר הנוכחי מציג פרוטוקולים להערכת המחויבות לגורל מוקדם של תאיT FH ספציפיים לווירוס ומניפולציה של ביטוי גנים בתאים אלה.

Abstract

תאי T מסייעים זקיקים (TFH) נתפסים כשושלת תאי CD4+ T עצמאית המסייעת לתאי B קוגניטיביים לייצר נוגדנים בעלי זיקה גבוהה, ובכך לבסס חסינות הומורלית ארוכת טווח. במהלך זיהום ויראלי חריף, מחויבות הגורל של תאי TFH ספציפיים לווירוס נקבעת בשלב ההדבקה המוקדם, וחקירות של תאי TFH ממוינים מוקדם הן חיוניות להבנת חסינות הומורלית תלוית תאי T ואופטימיזציה של תכנון החיסון. במחקר, תוך שימוש במודל עכברי של זיהום בנגיף הלימפוציטיס החריף (LCMV) ועכבר TCR-transgenic SMARTA (SM) עם תאי CD4+ T המזהים באופן ספציפי אפיטופ גליקופרוטאין LCMV I-AbGP66-77, תיארנו נהלים לגישה למחויבות הגורל המוקדמת של תאי TFH ספציפיים לווירוס בהתבסס על כתמי ציטומטריית זרימה. יתר על כן, על ידי ניצול התמרה רטרו-ויראלית של תאי T מסוג SM CD4+ , ניתנות גם שיטות למניפולציה של ביטוי גנים בתאי TFH ספציפיים לווירוס ממוינים מוקדם. לפיכך, שיטות אלה יסייעו במחקרים הבוחנים את המנגנונים העומדים בבסיס המחויבות המוקדמת של תאי TFH ספציפיים לנגיף.

Introduction

במפגש עם פתוגנים או איומים שונים, תאי T נאיביים CD4+ מתאימים את התגובה החיסונית שלהם על ידי התמיינות לתת-קבוצות שונות של תאי T מסייעים (TH) עם פונקציות מיוחדות1. בתרחיש של זיהום ויראלי חריף, חלק גדול מתאי T נאיביים CD4+ מתמיינים לתאי T מסייעים פוליקולריים (TFH) המספקים עזרה לתאי B 2,3. בניגוד לתת-קבוצות אחרות של תאי CD4+ TH (למשל, תאי TH1, TH2, TH9 ותאי TH17), תאיT FH מבטאים רמה משמעותית של CXCR5, שהוא קולטן הכימוקין של תאי B המבייתים כימוקין CXCL13, מה שמאפשר לתאיT FH לנדוד לזקיקים של תאי B. בזקיקי תאי B, תאיT FH מסייעים לתאי B קוגניטיביים ליזום ולשמר תגובות של מרכז הנבט, ובכך מאפשרים ייצור מהיר של נוגדנים בעלי זיקה גבוהה וזיכרון הומורלי ארוך טווח 2,3.

עם זיהום ויראלי חריף, מחויבות הגורל המוקדמת של תאי TFH ספציפיים לווירוס מתרחשת בתוך 72 שעות 4,5 ונשלטת על ידי לימפומה של תאי B מדכאי שעתוק -6 (Bcl-6)5,6,7,8, הפועלת כ”רגולטור הראשי” השולט בהחלטות גורל תאי TFH. מחסור ב-Bcl-6 מקהה באופן חמור את התמיינות תאי TFH, בעוד שביטוי חוץ רחמי של Bcl-6 מקדם באופן משמעותי מחויבות לגורל תאי TFH. בנוסף ל-Bcl-6, מולקולות רבות מעורבות בהנחיית מחויבות מוקדמת לגורל תאי TFH. גורמי שעתוק TCF-1 ו- LEF-1 יוזמים התמיינות תאי TFH באמצעות השראת Bcl-6 9,10,11. עיכוב Blimp1, הן על ידי Bcl-6 והן על ידי TCF-1, נדרש עבור התחייבות מוקדמת לגורל תאי TFH 11,12. STAT1 ו-STAT3 נדרשים גם עבור התמיינות מוקדמת של תאי TFH 13. חוץ מזה, שינויים אפיגנטיים על ידי היסטון methyltransferase EZH214,15 ו m6A methyltransferase METTL316 מסייעים לייצב תוכניות שעתוק תאי TFH (במיוחד Bcl6 ו Tcf7) ובכך ראשוני מוקדם TFH גורל הגורל. בעוד שהתקדמות, כולל המולקולות הנ”ל ואחרות, המסוכמות במקום אחר3, נעשו בהבנת תקנות השעתוק והאפיגנטיקה של מחויבות מוקדמת לגורל תאי TFH, מולקולות שלא היו ידועות קודם לכן נותרו ללמידה.

במודל העכבר של זיהום חריף של וירוס choriomeningitis לימפוציטית חריפה (LCMV), מועבר באופן מאומץ TCR-transgenic SMARTA (SM) CD4+ תאי T, אשר מזהים באופן ספציפי את אפיטופ הגליקופרוטאין LCMV I-AbGP66-77, עוברים התמיינות תאי TFH או TH1 במהלך זיהום ויראלי. דפוס התמיינות התפצלות TFH/TH1 תומך בקידום מודל זיהום SM/LCMV חריף בחקר הביולוגיה של תאי TFH ספציפיים לנגיף. ואכן, מודל זיהום SM/LCMV חריף נמצא בשימוש נרחב בתחום המחקר של תאי TFH ומילא תפקיד מכריע בתגליות אבני דרך בביולוגיה של תאי TFH. זה כולל את זיהוי Bcl-6 הנ”ל כגורם השעתוק המגדיר את השושלת של תאי TFH 5,6, כמו גם גורמי שעתוק חשובים אחרים (למשל, Blimp-16, TCF-1/LEF 9,10,11, STAT1/STAT313, STAT517, KLF218 ו- Itch19) המנחים התמיינות תאי TFH, תקנות לאחר שעתוק ( לדוגמה, METTL316 ו- miR-17~9220) של התמיינות תאי TFH, זיכרון תאי TFH ופלסטיות 21,22, ואסטרטגיות חיסון רציונליות המכוונות לתאי TFH (למשל, סלניום23).

המחקר הנוכחי מתאר שיטות ניתנות לשחזור לגישה למחויבות לגורל מוקדם של תאי TFH ספציפיים לנגיף, כולל (1) הקמת מודל עכבר כימרה SM נגוע LCMV חריף המתאים לגישה לתאי TFH ממוינים מוקדמים, (2) ביצוע צביעות ציטומטריה של זרימה של מולקולות הקשורות לתאי TFH ממוינים מוקדם, ו-(3) ביצוע מניפולציה גנטית רטרו-ויראלית מבוססת וקטור ב- SM CD4+ תאי T. שיטות אלה יהיו שימושיות למחקרים החוקרים את המחויבות לגורל מוקדם של תאי TFH ספציפיים לנגיף.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם לנהלים שאושרו על ידי הוועדות המוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית הצבאית השלישית. במחקר הנוכחי נעשה שימוש בזני העכברים הבאים: עכבר C57BL/6J (B6) (שני המינים), בגילאי 6 עד 8 שבועות, במשקל 25-30 גרם; CD45.1+SM TCR עכבר מהונדס (B6 CD45.1 × SM TCR מהונדס), שנ…

Representative Results

מאפיינים של תאי TFH ספציפיים לווירוס ממוינים מוקדם במהלך זיהום LCMV חריףכדי לחקור את מחויבות הגורל המוקדמת של תאי TFH ספציפיים לנגיף, תאי SM CD4+ T קונגניים נאיביים המזהים באופן ספציפי אפיטופ LCMV GP I-AbGP66-77 הועברו באימוץ למושתלי CD45.2+ C57BL/6. למחרת, המושתלי?…

Discussion

המחקר בתחום תאי TFH הודגש מאז גילוי הפונקציה המיוחדת של תאיT FH בסיוע לתאי B. מחקרים מצטברים הצביעו על כך שהתמיינות תאי TFH היא תהליך רב-שלבי ורב-גורמי30, שבו המחויבות לגורל תאי TFH נקבעת בשלב המוקדם5. לכן, הבנה טובה יותר של המנגנונים העומדים בבסיס ?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס ‘32300785 ל- X.C.), התוכנית הלאומית לפוסט-דוקטורט בסין לכישרונות חדשניים (No. BX20230449 ל-X.C.), והפרויקט הלאומי למדע וטכנולוגיה (מס’ 2021YFC2300602 ל-L.Y).

Materials

0.25% Trypsin-EDTA Corning 25-052-CI
4% Paraformaldehyde Fix Solution, 4% PFA Beyotime P0099-500mL
70 μm cell strainer Merck CLS431751
Alexa Fluor 647 anti-mouse TCR Vα2 (clone B20.1) Biolegend 127812 1:200 dilution
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.1 (clone A20) Biolegend 110724 1:200 dilution
APC anti-mouse CD25 (clone PC61) Biolegend 101910 1:200 dilution
B6 CD45.1 (B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ) mouse The Jackson Laboratory 002014
BeaverBeads Streptavidin Beaver 22321-10
Biotin anti-mouse F4/80 Antibody (clone BM8) Biolegend 123106 1:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse CD11c (clone N418) Biolegend 117304 1:200 dilution
Biotin Rat anti-Mouse CD19 (clone 6D5) Biolegend 115504 1:200 dilution
Biotin Rat anti-Mouse CD8a (clone 53-6.7) Biolegend 100704 1:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse NK-1.1 (clone PK136) Biolegend 108704 1:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (clone TER-119) Biolegend 116204 1:200 dilution
bovine serum albumin, BSA Sigma A7906
Brilliant Violet 421 anti-T-bet (clone 4B10) Biolegend 644816 1:100 dilution
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD279 (PD-1) (clone 29F.1A12) Biolegend 135220 1:200 dilution
C57BL/6J (B6) mouse The Jackson Laboratory 000664
CXCR5-GFP knock-in reporter mouse In house; the CXCR5-GFP knock-in mouse line was generated by the insertion of an IRES-GFP construct after the open reading frame of Cxcr5.
DMEM 10% medium DMEM medium containing 10% FBS
DMEM medium Gibco 11885092
EDTA Sigma E9884
FACSFortesa BD Biosciences
Fetal bovine serum, FBS Sigma F8318
FlowJo (version 10.4.0) BD Biosciences
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set Invitrogen 00-5523-00 The kit contains three reagents: a. Fixation/Permeabilization Concentrate (4X); b. Fixation / Permeabilization Diluent; c. Permeabilization Buffer.
Goat Anti-Rat IgG Antibody (H+L), Biotinylated Vector laboratories BA-9400-1.5 1:200 dilution
Invitrogen EVOS FL Auto Cell Imaging System ThermoFisher Scientific
Isolation buffer FACS buffer containing 0.5% BSA and 2mM EDTA
LCMV GP61-77 peptide (GLKGPDIYKGVYQFKSV) Chinese Peptide Company
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation Life Technologies L10199 1:200 dilution
MigR1 addgene #27490
NaN3 Sigma S2002
Opti-MEM medium Gibco 31985070
pCL-Eco addgene #12371
PE anti-mouse CD69 (clone H1.2F3) Biolegend 104508 1:200 dilution
PE Mouse anti-Bcl-6 (clone K112-91) BD Biosciences 561522 1:50 dilution
Phosphate buffered saline, PBS Gibco 10010072
Polybrene Solarbio H8761
Purified Rat Anti-Mouse CXCR5 (clone 2G8) BD Biosciences 551961 1:50 dilution
Rat monoclonal PerCP anti-mouse CD4 (clone RM4-5) Biolegend 100538 1:200 dilution
recombinant murine IL-2 Gibco 212-12-1MG
Red Blood Cell Lysis Buffer Beyotime C3702-500mL
RPMI 1640 medium Sigma R8758
RPMI 2% RPMI 1640 medium containing 2% FBS
SMARTA (SM) TCR transgenic mouse SM TCR transgenic line in our lab is a gift from Dr. Rafi Ahmed (Emory University). Additionally, this mouse line can also be obtained from The Jackson Laboratory (stain#: 030450).
Staining buffer PBS containing 2% FBS and 0.01% NaN3
Streptavidin PE-Cyanine7 eBioscience 25-4317-82 1:200 dilution
TCF1/TCF7 (C63D9) Rabbit mAb (Alexa Fluor 488 Conjugate)  Cell signaling technology 6444S 1:400 dilution
TFH cell staining buffer FACS buffer containing 1% BSA and 2% mouse serum
TransIT-293 reagent Mirus Bio MIRUMIR2700
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. O’shea, J. J., Paul, W. E. Mechanisms underlying lineage commitment and plasticity of helper CD4+ T cells. Science. 327 (5969), 1098-1102 (2010).
  2. Crotty, S. T follicular helper cell biology: A decade of discovery and diseases. Immunity. 50 (5), 1132-1148 (2019).
  3. Vinuesa, C. G., Linterman, M. A., Yu, D., Maclennan, I. C. Follicular helper t cells. Annu Rev Immunol. 34, 335-368 (2016).
  4. Choi, Y. S., et al. ICOS receptor instructs T follicular helper cell versus effector cell differentiation via induction of the transcriptional repressor bcl6. Immunity. 34 (6), 932-946 (2011).
  5. Choi, Y. S., et al. Bcl6 expressing follicular helper CD4 T cells are fate committed early and have the capacity to form memory. J Immunol. 190 (8), 4014-4026 (2013).
  6. Johnston, R. J., et al. Bcl6 and BLIMP-1 are reciprocal and antagonistic regulators of T follicular helper cell differentiation. Science. 325 (5943), 1006-1010 (2009).
  7. Nurieva, R. I., et al. Bcl6 mediates the development of T follicular helper cells. Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).
  8. Yu, D., et al. The transcriptional repressor bcl-6 directs T follicular helper cell lineage commitment. Immunity. 31 (3), 457-468 (2009).
  9. Choi, Y. S., et al. LEF1 and TCF1 orchestrate T(FH) differentiation by regulating differentiation circuits upstream of the transcriptional repressor bcl6. Nat Immunol. 16 (9), 980-990 (2015).
  10. Wu, T., et al. TCF1 is required for the t follicular helper cell response to viral infection. Cell Rep. 12 (12), 2099-2110 (2015).
  11. Xu, L., et al. The transcription factor TCF-1 initiates the differentiation of T(FH) cells during acute viral infection. Nat Immunol. 16 (9), 991-999 (2015).
  12. Oestreich, K. J., Mohn, S. E., Weinmann, A. S. Molecular mechanisms that control the expression and activity of bcl-6 in th1 cells to regulate flexibility with a TFH-like gene profile. Nat Immunol. 13 (4), 405-411 (2012).
  13. Choi, Y. S., Eto, D., Yang, J. A., Lao, C., Crotty, S. Cutting edge: STAT1 is required for IL-6-mediated bcl6 induction for early follicular helper cell differentiation. J Immunol. 190 (7), 3049-3053 (2013).
  14. Chen, X., et al. The histone methyltransferase ezh2 primes the early differentiation of follicular helper T cells during acute viral infection. Cell Mol Immunol. 17 (3), 247-260 (2020).
  15. Li, F., et al. Ezh2 programs T(FH) differentiation by integrating phosphorylation-dependent activation of bcl6 and polycomb-dependent repression of p19ARF. Nat Commun. 9 (1), 5452 (2018).
  16. Yao, Y., et al. METTL3-dependent m(6)A modification programs T follicular helper cell differentiation. Nat Commun. 12 (1), 1333 (2021).
  17. Johnston, R. J., Choi, Y. S., Diamond, J., Yang, J. A., Crotty, S. STAT5 is a potent negative regulator of TFH cell differentiation. J Exp Med. 209 (2), 243-250 (2012).
  18. Lee, J. Y., et al. The transcription factor KLF2 restrains CD4+ T follicular helper cell differentiation. Immunity. 42 (2), 252-264 (2015).
  19. Xiao, N., et al. The e3 ubiquitin ligase itch is required for the differentiation of follicular helper t cells. Nat Immunol. 15 (7), 657-666 (2014).
  20. Baumjohann, D., et al. The microRNA cluster mir-17~92 promotes TFH cell differentiation and represses subset-inappropriate gene expression. Nat Immunol. 14 (8), 840-848 (2013).
  21. Wang, Y., et al. The kinase complex mTORC2 promotes the longevity of virus-specific memory CD4(+) T cells by preventing ferroptosis. Nat Immunol. 23 (2), 303-317 (2022).
  22. Hale, J. S., et al. Distinct memory CD4+ T cells with commitment to T follicular helper- and T helper 1-cell lineages are generated after acute viral infection. Immunity. 38 (4), 805-817 (2013).
  23. Yao, Y., et al. Selenium-GPX4 axis protects follicular helper t cells from ferroptosis. Nat Immunol. 22 (9), 1127-1139 (2021).
  24. Oxenius, A., Bachmann, M. F., Zinkernagel, R. M., Hengartner, H. Virus-specific MHC-class II-restricted TCR-transgenic mice: Effects on humoral and cellular immune responses after viral infection. Eur J Immunol. 28 (1), 390-400 (1998).
  25. Grosjean, C., et al. Isolation and enrichment of mouse splenic t cells for ex vivo and in vivo T cell receptor stimulation assays. STAR Protoc. 2 (4), 100961 (2021).
  26. Dowling, P., et al. Protocol for the bottom-up proteomic analysis of mouse spleen. STAR Protoc. 1 (3), 100196 (2020).
  27. Choi, Y. S., Crotty, S. Retroviral vector expression in TCR transgenic CD4+ T cells. Methods Mol Biol. 1291, 49-61 (2015).
  28. Wu, D., et al. A method for expansion and retroviral transduction of mouse regulatory T cells. J Immunol Methods. 488, 112931 (2021).
  29. He, R., et al. Follicular CXCR5- expressing CD8(+) T cells curtail chronic viral infection. Nature. 537 (7620), 412-428 (2016).
  30. Crotty, S. Follicular helper CD4 T cells (TFH). Annu Rev Immunol. 29, 621-663 (2011).
  31. Breitfeld, D., et al. Follicular B helper T cells express CXC chemokine receptor 5, localize to B cell follicles, and support immunoglobulin production. J Exp Med. 192 (11), 1545-1552 (2000).
  32. Xu, L., et al. The kinase mTORC1 promotes the generation and suppressive function of follicular regulatory t cells. Immunity. 47 (3), 538-551 (2017).
  33. Chen, X., et al. The phosphatase pten links platelets with immune regulatory functions of mouse T follicular helper cells. Nat Commun. 13 (1), 2762 (2022).
  34. Chen, J. S., et al. Flow cytometric identification of T(fh)13 cells in mouse and human. J Allergy Clin Immunol. 147 (2), 470-483 (2021).

Tags

Follicular Helper T (TFH) CellsVirus-specific TFH CellsAcute Viral InfectionLCMV InfectionSMARTA MouseTCR-transgenicEarly Fate CommitmentFlow CytometryRetroviral TransductionGene Expression Manipulation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Lin, Y., Yue, S., Yang, Y., He, J., Yang, X., Ye, L., Chen, X. Accessing Early Differentiation of Virus-Specific Follicular Helper CD4+ T Cell in Acute LCMV-Infected Mice. J. Vis. Exp. (206), e66752, doi:10.3791/66752 (2024).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image