Differenziamento e caratterizzazione di osteoclasti da cellule staminali pluripotenti indotte umane

Gli osteoclasti (OC) sono tipi di cellule di derivazione ematopoietica ^1,2, versatili che sono comunemente usati dai ricercatori in aree come la ricerca sulle malattie ossee ^3,4, la ricerca sul cancro ^5,6, l’ingegneria tissutale ^7,8 e la ricerca sull’endoprotesi ^9,10. Ciononostante, il differenziamento degli OC può essere impegnativo in quanto la fusione di precursori mononucleari in OC multinucleati è necessaria per creare OC funzionali¹¹. Diversi fattori biologici, come l’attivatore del recettore del ligando NF-κB (RANKL) e il fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF), sono necessari per la differenziazione dell’OC. È stato riportato che M-CSF ha un effetto positivo sulla proliferazione cellulare, sulla sopravvivenza cellulare e sull’espressione di RANK 12,13,14. D’altra parte, RANKL si lega a RANK, che attiva cascate di segnalazione a valle che inducono l’osteoclastogenesi. L’attivazione è mediata dal fattore 6 associato al recettore del TNF (TRAF6), che porta alla degradazione del fattore nucleare del potenziatore genico del polipeptide leggero kappa nell’inibitore delle cellule B, alfa (IκB-α), una proteina legante che lega i dimeri NF-kB^16,17. Quindi, la degradazione di IκB-α rilascia dimeri di NF-kB, che poi traslocano nel nucleo e inducono l’espressione dei fattori di trascrizione c-Fos e del fattore nucleare delle cellule T attivate 1 (NFATc1). Questo, a sua volta, innesca la trascrizione di una moltitudine di proteine correlate al differenziamento OC^15,18. Le proteine sovraregolate come DC-Stamp e Atp6v0d2 mediano la fusione cellula-cellula dei precursori OC, portando alla formazione del sincizio 19,20,21.

Per quanto riguarda le cellule primarie umane, le PBMC CD34⁺ e CD14⁺ sono attualmente i tipi cellulari più utilizzati per il differenziamento in OC²². Tuttavia, questo approccio è limitato dall’eterogeneità all’interno della popolazione CD34⁺ di cellule raccolte da donatori²³ e dalla loro limitata espandibilità. Le iPSC umane rappresentano una fonte alternativa per gli OC. Poiché possono essere propagati indefinitamente²⁴, consentono l’espandibilità e l’upscaling della produzione di OC. Ciò consente la differenziazione di un gran numero di OC, il che facilita la ricerca OC.

Sono stati pubblicati diversi protocolli per la differenziazione delle iPSC in OC 25,26,27. L’intero processo di differenziazione può essere suddiviso in una parte di propagazione delle iPSC, una parte di differenziazione mesodermica ed ematopoietica e una parte di differenziazione OC. La propagazione delle iPSC prima del processo di differenziazione consente l’aumento della produzione di OC prima della differenziazione. Esistono diversi approcci per quanto riguarda il differenziamento mesodermico ed ematopoietico. Tradizionalmente, la formazione di corpi embrioidi (EB) è stata utilizzata per differenziare le cellule ematopoietiche, ma gli approcci basati sul monostrato rappresentano un’altra strategia di differenziamento ematopoietico che non richiede l’induzione di EB. Ciononostante, i sistemi basati su monostrato sembrano richiedere un’ulteriore ottimizzazione, poiché noi e altri abbiamo trovato gli approcci basati sull’EB più robusti per la differenziazione degli OC.

Qui, descriviamo la differenziazione delle OC dalle iPSC umane utilizzando un protocollo basato su EB. Questo protocollo è stato adattato da Rössler et ^al.26 e modificato per aumentare la robustezza e consentire la crioconservazione durante il processo di differenziazione. In primo luogo, abbiamo raccolto cellule ematopoietiche solo una volta dopo 10 giorni di differenziazione. Le cellule ematopoietiche sono state quindi crioconservate per consentire una maggiore flessibilità durante il processo di differenziazione. Inoltre, abbiamo aumentato la densità di semina delle cellule ematopoietiche da 1 x 10⁵ a 2 x 10⁵ cellule/cm² per la differenziazione OC. È stato utilizzato un terreno umano più recente privo di siero iPSC (hiPSC-SFM, vedi Tabella dei materiali) e il rivestimento dei pozzetti è stato eseguito con 200-300 μg/mL di un estratto di membrana basale (vedi Tabella dei materiali) invece dello 0,1% di gelatina. La penicillina/streptomicina non è stata aggiunta ai media.

Il protocollo di Rössler et ^al.26 è stato originariamente adattato da una iPSC a un protocollo di differenziazione dei macrofagi²⁸ che utilizza la formazione di EB per la differenziazione ematopoietica. Mentre la formazione di EB è stata utilizzata per un lungo periodo di tempo dai ricercatori per la differenziazione ematopoietica^29,30, in letteratura sono stati descritti diversi metodi di induzione di EB, come l’aggregazione spontanea, la centrifugazione in una piastra a pozzetti a fondo tondo, la coltura a goccia sospesa, la coltura di bioreattori, la coltura di tubi conici, il vaso laterale a rotazione lenta e la coltura di gel micromold³¹. Questo protocollo utilizza la centrifugazione di iPSC dissociate in una piastra a pozzetti a fondo tondo per avvicinare le singole cellule iPSC l’una all’altra e consentire la formazione di sfere (EB), come descritto di seguito.