Diferenciação e Caracterização de Osteoclastos de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas Humanas

Os osteoclastos (CO) são derivados da^{hematopoética1,2}, tipos celulares versáteis e comumente utilizados por pesquisadores em áreas como pesquisa de doenças^ósseas3,4, pesquisa de^câncer5,6, engenharia de^tecidos7,8 e pesquisa de endopróteses9,10. No entanto, a diferenciação de CO pode ser desafiadora, uma vez que a fusão de precursores mononucleares em COs multinucleados é necessária para criar CO funcionais¹¹. Vários fatores biológicos, como o receptor ativador do ligante NF-κB (RANKL) e o fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF), são necessários para a diferenciação do CO. Foi relatado que o M-CSF tem um efeito positivo sobre a proliferação celular, sobrevivência celular e expressão de RANK 12,13,14. Por outro lado, o RANKL liga-se ao RANK, que ativa cascatas de sinalização a jusante que induzem a osteoclastogênese. A ativação é mediada pelo fator 6 associado ao receptor de TNF (TRAF6), que leva à degradação do fator nuclear do intensificador do gene do polipeptídeo kappa light no inibidor de células B, alfa (IκB-α), uma proteína ligadora que se liga aos dímeros do NF-kB^16,17. Assim, a degradação de IκB-α libera dímeros de NF-kB, que então se translocam para o núcleo e induzem a expressão dos fatores de transcrição c-Fos e Fator Nuclear de Células T Ativadas 1 (NFATc1). Isso, por sua vez, desencadeia a transcrição de uma infinidade de proteínas relacionadas à diferenciação dos CO ^15,18. Proteínas upregulated como DC-Stamp e Atp6v0d2 medeiam a fusão célula-célula de precursores de OC, levando à formação de sincício 19,20,21.

Com relação às células primárias humanas, as CMSP CD34⁺ e CD14⁺ são atualmente os tipos celulares mais utilizados para diferenciação em^CO22. No entanto, essa abordagem é limitada pela heterogeneidade dentro da população CD34⁺ de células colhidas de doadores²³ e sua limitada capacidade de expansão. As iPSCs humanas apresentam uma fonte alternativa para os COs. Como podem ser propagados indefinidamente²⁴, permitem a expansibilidade e o upscaling da produção de OC. Isso permite a diferenciação de um grande número de COs, o que facilita a pesquisa de CO.

Vários protocolos para a diferenciação de iPSCs em CO foram publicados 25,26,27. Todo o processo de diferenciação pode ser dividido em uma parte de propagação de iPSC, uma parte de diferenciação mesodérmica e hematopoiética e diferenciação de OC. A propagação de iPSCs antes do processo de diferenciação permite o aumento da produção de OC antes da diferenciação. Existem várias abordagens em relação à diferenciação mesodérmica e hematopoiética. Tradicionalmente, a formação do corpo embrióide (BE) tem sido usada para diferenciar células hematopoéticas, mas abordagens baseadas em monocamadas representam outra estratégia de diferenciação hematopoética que não requer indução de EB. No entanto, sistemas baseados em monocamadas parecem exigir maior otimização, pois nós e outros descobrimos que as abordagens baseadas em EB são mais robustas para a diferenciação de OCs.

Aqui, descrevemos a diferenciação de COs de iPSCs humanas usando um protocolo baseado em EB. Esse protocolo foi adaptado de Rössler et ^al.26 e modificado para aumentar a robustez e permitir a criopreservação durante o processo de diferenciação. Primeiro, colhemos as células hematopoéticas apenas uma vez após 10 dias de diferenciação. As células hematopoéticas foram então criopreservadas para permitir maior flexibilidade durante o processo de diferenciação. Adicionalmente, aumentamos a densidade de semeadura de células hematopoéticas de 1 x 10⁵ para 2 x 10⁵ células/^cm2 para diferenciação de CO. Um meio iPSC humano isento de soro mais recente (hiPSC-SFM, ver Tabela de Materiais) foi usado, e o revestimento dos poços foi realizado com 200-300 μg/mL de um extrato de membrana basal (ver Tabela de Materiais) em vez de 0,1% de gelatina. Penicilina/estreptomicina não foi adicionada à mídia.

O protocolo de Rössler et ^al.26 foi originalmente adaptado de uma iPSC para um protocolo de diferenciação de macrófagos28 que utiliza a formação de EB para diferenciação hematopoiética. Embora a formação da EB tenha sido utilizada por tempo prolongado por pesquisadores para diferenciação hematopoética^29,30, vários métodos de indução da EB têm sido descritos na literatura, como agregação espontânea, centrifugação em placa de poço de fundo redondo, cultura em gota suspensa, cultura em biorreator, cultura de tubo cônico, vaso lateral de giro lento e cultura em gel de micromolde³¹. Este protocolo utiliza a centrifugação de iPSCs dissociadas em uma placa de poço de fundo redondo para aproximar células iPSC únicas umas das outras e permitir a formação de esferas (EB), como descrito a seguir.