인간 유도 만능 줄기 세포에서 파골세포의 분화 및 특성화
Summary
이 프로토콜은 유도만능줄기세포(iPSC)에서 인간 파골세포의 분화를 제시하고 파골세포 및 파골세포 전구체의 특성 분석 방법을 설명합니다.
Abstract
이 프로토콜은 인간 iPSC의 증식 및 패시징과 파골세포로의 분화에 대해 자세히 설명합니다. 첫째, iPSC는 배아체 유도에 추가로 사용하기 위해 단세포 현탁액으로 해리됩니다. 중배엽 유도 후 배아체는 조혈 분화를 거쳐 부유 조혈 세포 집단을 생성합니다. 그 후, 수확된 조혈 세포는 대식세포 콜로니 자극 인자 성숙 단계를 거치고 마지막으로 파골세포 분화를 거칩니다. 파골세포 분화 후, 파골세포는 메틸 그린 핵 염색과 함께 TRAP에 대한 염색을 특징으로 합니다. 파골세포는 다핵, TRAP+ 다핵으로 관찰됩니다. 이들의 식별은 카텝신 K 염색에 의해 더욱 뒷받침될 수 있습니다. 뼈 및 미네랄 흡수 분석은 기능적 특성 분석을 가능하게 하여 진정한 파골세포의 정체성을 확인합니다. 이 프로토콜은 인간 파골세포와 iPSC를 구별하는 강력하고 다재다능한 방법을 보여주며, 대량의 기능성 인간 파골세포가 필요한 응용 분야에 쉽게 채택할 수 있습니다. 뼈 연구, 암 연구, 조직 공학 및 내보철물 연구 분야의 응용 프로그램을 구상할 수 있습니다.
Introduction
파골세포(occteoclast, OC)는 조혈 유래 1,2, 다용도 세포 유형으로, 뼈 질환 연구 3,4, 암 연구 5,6, 조직 공학 7,8, 내보철물 연구 9,10 등의 분야에서 연구자들이 일반적으로 사용합니다. 그럼에도 불구하고, 기능적 OC를 생성하기 위해서는 단핵 전구체를 다핵 OC로 융합하는 것이 필요하기 때문에 OC 분화는 어려울 수 있다11. NF-κB 리간드의 수용체 활성제(RANKL) 및 대식세포 집락 자극 인자(M-CSF)와 같은 여러 생물학적 요인이 OC 분화에 필요합니다. M-CSF는 세포 증식, 세포 생존 및 RANK 발현 12,13,14에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 보고되었습니다. 반면에 RANKL은 RANK에 결합하여 골쇄골 형성을 유도하는 다운스트림 신호 캐스케이드를 활성화합니다. 활성화는 TNF 수용체 관련 인자 6 (TRAF6)을 통해 매개되며, 이는 B 세포 억제제, 알파 (IκB-α), NF-kB 이량체16,17에 결합하는 결합 단백질에서 카파 광 폴리펩티드 유전자 인핸서의 핵 인자의 분해를 유도합니다. 따라서 IκB-α 분해는 NF-kB 이량체를 방출하고, 이 이량체는 핵으로 전위되어 전사 인자 c-Fos 및 활성화된 T 세포의 핵 인자 1(NFATc1)의 발현을 유도합니다. 이것은 차례로 다수의 OC 분화 관련 단백질15,18의 전사를 유발합니다. DC-Stamp 및 Atp6v0d2와 같은 상향 조절 단백질은 OC 전구체의 세포-세포 융합을 매개하여 세포융합 형성을 유도합니다 19,20,21.
인간 일차 세포와 관련하여 CD34+ 및 CD14+ PBMC는 현재 OC22로 분화하는 데 가장 널리 사용되는 세포 유형입니다. 그러나, 이러한 접근법은 공여체23으로부터 수확된 세포의 CD34+ 집단 내의 이질성 및 이들의 제한된 확장성에 의해 제한된다. 인간 iPSC는 OC에 대한 대체 소스를 제공합니다. 24 무한정 전파 될 수 있기 때문에 OC 생산의 확장 가능성과 업스케일링이 가능합니다. 이를 통해 많은 수의 OC를 구별할 수 있어 OC 연구를 용이하게 할 수 있습니다.
iPSC를 OC로 분화하기 위한 몇 가지 프로토콜이 발표되었습니다 25,26,27. 전체 분화 과정은 iPSC 증식 부분, 중배엽 및 조혈 분화 부분, OC 분화로 나눌 수 있습니다. 분화 공정 전에 iPSC를 전파하면 분화 전에 OC 생산을 업스케일링할 수 있습니다. 중배엽 및 조혈 분화에 관한 몇 가지 접근법이 존재합니다. 전통적으로 배아체(EB) 형성은 조혈 세포를 분화하는 데 사용되어 왔지만, 단층 기반 접근법은 EB 유도가 필요하지 않은 또 다른 조혈 분화 전략입니다. 그럼에도 불구하고 단층 기반 시스템은 EB 기반 접근 방식이 OC의 차별화에 더 강력하다는 것을 발견했기 때문에 추가 최적화가 필요한 것으로 보입니다.
여기서는 EB 기반 프로토콜을 사용하여 OC와 인간 iPSC의 차이점을 설명합니다. 이 프로토콜은 Rössler et al.26 에서 채택되었으며 분화 과정에서 견고성을 높이고 동결 보존을 허용하도록 수정되었습니다. 첫째, 조혈 세포는 분화 10일 후 한 번만 채취했습니다. 그런 다음 조혈 세포를 동결 보존하여 분화 과정에서 더 많은 유연성을 허용했습니다. 또한 OC 분화를 위해 조혈 세포 파종 밀도를 1 x 105 에서 2 x 105 cells/cm2 로 늘렸습니다. 보다 최근의 인간 iPSC 무혈청 배지(hiPSC-SFM, 재료 표 참조)를 사용하고, 0.1% 젤라틴 대신 200-300μg/mL의 기저막 추출물( 재료 표 참조)로 웰 코팅을 수행했습니다. 페니실린/스트렙토마이신은 배지에 첨가되지 않았습니다.
Rössler et al.26에 의한 프로토콜은 원래 iPSC에서 조혈 분화를 위해 EB 형성을 사용하는 대식세포 분화 프로토콜(28)로 조정되었습니다. EB 형성은 조혈 분화를 위해 연구자들에 의해 오랜 시간 동안 사용되어 왔지만29,30, EB 유도의 여러 방법이 자발적 응집, 둥근 바닥 웰 플레이트에서의 원심분리, 행잉 드롭 배양, 생물 반응기 배양, 원추형 튜브 배양, 느린 회전 측면 용기 및 마이크로몰드 겔 배양31과 같은 여러 가지 방법이 문헌에 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 둥근 바닥 웰 플레이트에서 해리된 iPSC의 원심분리를 사용하여 단일 iPSC 세포를 서로 근접하게 만들고 후술하는 바와 같이 구(EB) 형성을 허용합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 iPSC를 OC로 구별할 수 있는 신뢰할 수 있고 강력한 방법을 제공합니다. 그럼에도 불구하고 차별화 프로세스 전반에 걸쳐 발생할 수 있는 몇 가지 함정이 있습니다. 상이한 조직 기원의 세포로부터 생성된 인간 iPSC 라인은 이 프로토콜(33)을 사용하여 성공적으로 분화되었다. iPSC를 다시 동결할 때(프로토콜 단계 “3. Freezing back iPSCs”), passaging 지점의 웰 하나를 다시 하?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 Giachelli 연구소의 기술적인 도움과 지원에 감사를 표하고 싶습니다. 컨포칼 현미경 및 광시야 현미경 이미지를 얻는 데 도움을 주신 W. M. Keck Microscopy Center와 Keck Center 관리자인 Dr. Nathanial Peters에게 감사드립니다. 또한 기술 지원 및 도움을 주신 UW Flow Core Facility와 Flow Core Facility 관리자인 Aurelio Silvestroni에게도 감사드립니다. 마지막으로, 일러스트레이션과 그래픽 디자인을 지원해 주신 Hannah Blümke에게 감사드립니다.
자금은 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 보조금 R35 HL139602-01을 통해 제공되었습니다. 또한 W. M. Keck Center의 기기 자금 지원을 위한 NIH S10 보조금 S10 OD016240와 UW Flow Core Facility의 기기 자금 조달을 위한 NIH 보조금 1S10OD024979-01A1을 인정합니다.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250-10ML | |
| Antibody – Anti-Cathepsin K | Abcam | ab19027 | |
| Antibody – APC-conjugated Anti-Human CD45 | BD | 555485 | |
| Antibody – APC-conjugated Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD | 555751 | |
| Antibody – BV711-conjugated Anti-Human CD14 | BD | 563372 | |
| Antibody – BV711-conjugates Mouse IgG2b, κ Isotype Control | BD | 563125 | |
| Antibody – Goat Anti-Rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 647 | Abcam | ab150079 | |
| Antibody – PE-conjugated Anti-Human CD14 | R&D Systems | FAB3832P-025 | |
| Antibody – PE-conjugated Anti-Human Integrin alpha M/CD11b | R&D Systems | FAB16991P-025 | |
| Antibody – PE-Cy7-conjugated Anti-Human CD34 | BD | 560710 | |
| Antibody – PE-Cy7-conjugated Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD | 557872 | |
| Antibody – PE/Cyanine5-conjugated Anti-Human CD11b | Biolegend | 301308 | |
| Antibody – PE/Cyanine5-conjugated Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl | Biolegend | 400118 | |
| Antibody – PerCP-Cy5.5-conjugated Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD | 550795 | |
| Antibody – PerCpCy5.5-conjugated Anti-Human CD43 | BD | 563521 | |
| Bone Resorption Assay Kit | CosmoBioUSA | CSR-BRA-24KIT | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | ThermoFisher | 16812556 | |
| Cultrex Stem Cell Qualified Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract | R&D Sytems | 3434-010-02 | Basal membrane extract |
| DAPI | R&D Systems | 5748/10 | |
| Dispase (5 U/mL) | STEMCELL Technologies | 7913 | |
| DMEM/F-12 with 15 mM HEPES | Stem Cell | 36254 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DPBS | Sigma Aldrich | D8537-500ML | |
| Human Bone Morphogenetic Protein 4 (hBMP4) | STEMCELL Technologies | 78211 | |
| Human IL-3 | STEMCELL Technologies | 78146.1 | |
| Human Macrophage Colony-stimulating Factor (hM-CSF) | STEMCELL Technologies | 78150.1 | |
| Human Soluble Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand (hsRANKL) | STEMCELL Technologies | 78214.1 | |
| Human Stem Cell Factor (hSCF) | STEMCELL Technologies | 78155.1 | |
| Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution) | Biolegend | 422301 | |
| Human Vascular Endothelial Growth Factor-165 (hVEGF165) | STEMCELL Technologies | 78073 | |
| Invitrogen Rhodamine Phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| MEM α, nucleosides, no phenol red | ThermoFisher | 41061029 | |
| mFreSR | STEMCELL Technologies | 05855 | Serum free cryopreservation medium |
| mTeSR Plus medium | STEMCELL Technologies | 100-0276 | Human iPSC-serum free medium (hiPSC-SFM) |
| Nunclon Sphera 96-Well, Nunclon Sphera-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate | Thermo Scientific | 174925 | Round bottom ultra-low attachment 96-well plate |
| P1000 Wide Bore Tips | ThermoFisher | 2079GPK | |
| ROCK-Inhibitor Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | |
| StemSpan SFEM | StemCell | 09650 | Hematopoietic cell culture medium |
| TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red | Thermo Fisher | 12563011 | Single-cell dissociation reagent |
| Ultraglutamine | Bioscience Lonza | BE17-605E/U1 | |
| X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium | Bioscience Lonza | 04-418Q | Hematopoietic basal medium |
| µ-Slide 8 Well High | Ibidi | 80806 |
Referencias
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