Beyin Organoidlerinde Tek Hücreli ve Tek Çekirdekli Transkriptomların Oluşumu ve Aşağı Akış Analizi
Summary
Burada, tek hücreli ve tek çekirdekli RNA dizilimi kullanarak insan beyni organoidlerinin üretilmesi ve aşağı akış analizi için kapsamlı bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Son on yılda, tek hücreli transkriptomik, tek tek hücrelerin gen ekspresyon profillerinin eşzamanlı analizi için önemli ölçüde gelişti ve hücresel çeşitliliğin yakalanmasına izin vererek standart bir laboratuvar yöntemi haline geldi. İzole edilmesi zor hücre tiplerinin getirdiği sınırlamaların üstesinden gelmek için, dizileme için sağlam hücreler yerine tek çekirdekleri geri kazanmayı amaçlayan alternatif bir yaklaşım kullanılabilir ve bu da tek tek hücrelerin transkriptom profillemesini evrensel olarak uygulanabilir hale getirir. Bu teknikler, beyin organoidlerinin incelenmesinde bir mihenk taşı haline geldi ve onları gelişmekte olan insan beyninin modelleri haline getirdi. Beyin organoid araştırmalarında tek hücreli ve tek çekirdekli transkriptomiklerin potansiyelinden yararlanan bu protokol, organoid ayrışma, tek hücreli veya çekirdek izolasyonu, kütüphane hazırlama ve dizileme gibi temel prosedürleri kapsayan adım adım bir kılavuz sunar. Araştırmacılar, bu alternatif yaklaşımları uygulayarak, nöronal ve nöronal olmayan hücre tiplerinin, gen ekspresyon profillerinin ve hücre soy yörüngelerinin tanımlanmasını sağlayan yüksek kaliteli veri kümeleri elde edebilirler. Bu, beyin gelişimini şekillendiren hücresel süreçler ve moleküler mekanizmalar hakkında kapsamlı araştırmaları kolaylaştırır.
Introduction
Son yıllarda, organoid teknolojileri, organ benzeri dokuları kültürlemek için umut verici bir araç olarak ortaya çıkmıştır 1,2,3. Özellikle insan beyni gibi kolayca erişilemeyen organlar için organoidler, gelişim ve hastalık tezahürü hakkında bilgi edinme fırsatı sunar4. Bu nedenle, beyin organoidleri, gelişimsel, psikiyatrik ve hatta nörodejeneratif hastalıklar dahil olmak üzere çeşitli insan beyni bozukluklarını araştırmak için deneysel bir model olarak yaygın olarak kullanılmaktadır 4,5,6.
Tek hücreli transkriptom profilleme teknolojilerinin ortaya çıkmasıyla, birincil insan dokuları ve karmaşık in vitro modeller, sağlık ve hastalıktaki hücre alt popülasyonları düzeyinde gen ekspresyonu değişikliklerine ilişkin mekanik içgörüler sağlayarak ve yeni varsayılan terapötik hedefler hakkında bilgi vererek, benzeri görülmemiş bir ayrıntı düzeyi ile incelenebilir 7,8,9. Organoid alan, hücresel bileşimi, tekrarlanabilirliği ve beyin organoid teknolojilerinin doğruluğunu değerlendirmek için tek hücreli transkriptom profillemesi kullanılarak ilerlemiştir 10,11,12. Tek hücreli RNA dizilimi (scRNA-dizilimi), hastalıklı organoidlerde hücre sınıflandırmasını ve genetik düzensizliğin tanımlanmasını sağladı13,14. Daha da önemlisi, tek tek hücrelerin profillenmesini sağlayan tekniklerin uygulanmasını gerektiren organoid dokuların karmaşıklığıdır. Toplu transkriptom profillemesi (toplu RNA dizilimi) gibi yöntemler kullanılarak organoidlerin karakterizasyonu, karmaşık doku içindeki tüm hücre tiplerinde ortalaması alınan maskelenmiş hücresel heterojenliğe ve gen ekspresyon profillerine yol açar ve sonuçta sağlık ve hastalıkta organoid gelişimi sırasında devam eden süreçlere ilişkin anlayışımızı sınırlar 15,16,17. ScRNA-seq yöntemleri ilerlemeye devam ettikçe, Allen Beyin Atlası veya Uzquiano ve arkadaşlarının insan beyni organoidlerinin Tek hücreli atlası gibi kaynaklarla örneklenen artan sayıda atlas oluşturulmaktadır.18.
Beyin organoidlerinden başarılı bir scRNA dizilimi gerçekleştirmek, sağlam hücrelerin etkili bir şekilde izole edilmesine ve yakalanmasına dayanır. Tek tek hücreler elde etmek için beyin organoidlerinin ayrışması enzimatik sindirime dayandığından, stres ve hücre hasarına neden olarak gen ekspresyon modellerini etkileyebilir19,20. Bu nedenle, dokunun tek tek hücrelere ayrışması en önemli adımdır. Alternatif bir yaklaşım, çekirdeklerin hem taze hem de donmuş dokudan enzim içermeyen ekstraksiyonunu kolaylaştıran tek çekirdekli RNA dizilemesidir (snRNA-dizilimi)21,22. Bununla birlikte, çekirdeklerin bir dokudan izole edilmesi, ilgilenilen hücre tiplerinin zenginleştirilmesi ve hücrelere kıyasla çekirdeklerin düşük RNA içeriği gibi başka zorluklar da ortaya çıkarmaktadır.
Beyin organoidlerinin transkriptom çalışmaları genellikle scRNA-seq 10,18,23 kullanılarak yürütülür. Bununla birlikte, tek çekirdeklerin izolasyonu, organoidlerin transkriptomik profilini araştırmak için ortogonal ve tamamlayıcı bir yöntem sağlayabilir. Burada, beyin organoidleri için scRNA ve snRNA-seq için bir araç kutusu tanıtıyoruz ve en iyi kalitede dizileme verilerini elde etmek için kritik noktaları tartışıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tek hücrelerin ve tek çekirdeklerin transkriptomik analizi, karmaşık dokulardaki gen düzenleyici mekanizmaları anlamak için çok önemli bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Her iki yöntem de beyin organoidlerinin transkriptom çalışmalarını mümkün kılar. Genel olarak başarılı bir deney sağlamak için, başlangıç malzemesinin kalitesi yüksek öneme sahiptir. Bu nedenle, nekrotik bir çekirdek oluşumunu önlemek için organoidleri düzenli olarak kesmek gerekir26. Bu sorun…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Miltenyi Nöral Ayrışma kitinin orijinal talimatları için Valeria Fernandez-Vallone’ye teşekkür ederiz. Ayrıca, Max Delbrueck Centrum’un Genomik Teknoloji Platformuna, NP40 lizis tamponunun tarifini ve bu protokolü kurarken değerli tavsiyeleri sağladığı için teşekkür ederiz. Ayrıca Margareta Herzog ve Alexandra Tschernycheff’e laboratuvar organizasyonel desteği için teşekkür ederiz.
Materials
| 1,4-DITHIO-DL-THREIT-LSG., F. D. MOL.-BIOL., ~1 M IN H2O (DTT) | Sigma | 43816-10ML | |
| 1.5 ml DNA low binding tubes | VWR | 525-0130 | microcentrifuge tube |
| 10x Cellranger pipeline | analysis pipline | ||
| 15 ml Falcon | Falcon | Centrifuge tube | |
| 2-Mercaptoethanol (BME) | Life Technologies | 21985023 | |
| 50 ml Falcon | Falcon | Centrifuge tube | |
| A83-01 | Bio Technologies | 379762 | |
| Antibiotic/Antimycotic Solution (100X) | Life Technologies | 15240062 | |
| B-27 Plus Supplement | Life Technologies | 17504044 | |
| B-27 Supplement without vitamin A | Life Technologies | 12587010 | |
| Bovine serum albumin, fatty acid free (BSA) | Sigma Aldrich | A8806-5G | |
| cAMP | Biogems | 6099240 | |
| cAMP | Biogems | 6099240 | |
| C-CHIP NEUBAUER IMPROVED | VWR | DHC-N01 | |
| Cell strainer 40 µm | Neolab | 352340 | |
| Cell strainer 70 µm (white) Nylon | Sigma | CLS431751-50EA | |
| Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit | 10X Genomics | 1000204 | |
| Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns | 10X Genomics | 1000127 | |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.1 | 10X Genomics | 1000268 | |
| Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktaill | Roche | 11873580001 | |
| DAPI | MERCK Chemicals | 0000001722 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320074 | |
| Dounce tissue grinder set 2 mL complete | Sigma Aldrich | 10536355 | |
| Essential E8 Flex Medium | Life Technologies | A2858501 | |
| EVE Cell Counting Slides | VWR | EVS-050 ( 734-2676) | |
| Foetal bovine serum tetracycline free (FBS) | PAN Biotech | P30-3602 | |
| Geltrex LDEV-Free (coating) | Life Technologies | A1413302 | |
| gentleMACS | Miltenyi Biotec | dissociation maschine | |
| GlutaMAX supplements | Life Technologies | 35050038 | |
| Heparin sodium cell culture tested | Sigma | H3149-10KU | |
| human recombinant BDNF | StemCell Technologies | 78005.3 | |
| human recombinant GDNF | StemCell Technologies | 78058.3 | |
| Insulin Solution Human | Sigma Aldrich | I2643-25MG | |
| Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828028 | |
| LDN193189 Hydrochloride 98% | Sigma Aldrich | 130-106-540 | |
| MEM non-essential amino acid (100x) | Sigma Aldrich | M7145-100ml | |
| MgCl2 Magnesium Chloride (1M) RNAse free | Thermo Scientific | AM9530G | |
| mTeSR Plus | StemCell Technologies | 100-0276 | stem cell medium |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | stem cell medium |
| N2 Supplement | StemCell Technologies | 17502048 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG | 130-092-628 | |
| Neurobasal Plus | Life Technologies | A3582901 | |
| NextSeq500 system | Illumina | Sequencer | |
| NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution | Life Technologies | 28324 | |
| PBS Dulbecco’s | Invitrogen | 14190169 | |
| PenStrep (Penicillin – Streptomycin) | Life Technologies | 15140122 | |
| Percoll | Th. Geyer | 10668276 | |
| Pluronic (R) F-127 | Sigma Aldrich | P2443-1KG | |
| RiboLock RNase Inhibitor | Life Technologies | EO0382 | |
| Rock Inhibitor (Y-27632 dihydrochloride) SB | Biomol | Cay10005583-10 | |
| SB 431542 | Biogems | 3014193 | |
| Sodium chloride NaCl (5M), RNase-free-100 mL | Invitrogen | AM9760G | |
| StemFlex Medium | Thermo Scientific | A3349401 | stem cell medium |
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotec | 130-104-368 | stem cell medium |
| TC-Platte 96 Well, round bottom | Sarstedt | 83.3925.500 | |
| TISSUi006-A | TissUse GmbH | https://hpscreg.eu/cell-line/TISSUi006-A | |
| Trypan Blue | T8154-20ml | Sigma | |
| TrypLE Express Enzyme, no phenol red | Life Technologies | 12604013 | Trypsin-based reagent |
| UltraPure 1M Tris-HCl Buffer, pH 7.5 | Life Technologies | 15567027 | |
| XAV939 | Enzo Life sciences | BML-WN100-0005 |
Referencias
- Finkbeiner, S. R., et al. Stem cell-derived human intestinal organoids as an infection model for Rotaviruses. mBio. 3 (4), e00159-e00212 (2012).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nat Commun. 6, 8715 (2015).
- Guan, Y., et al. Human hepatic organoids for the analysis of human genetic diseases. JCI Insight. 2 (17), e94954 (2017).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Dang, J., et al. Zika virus depletes neural progenitors in human cerebral organoids through activation of the innate immune receptor TLR3. Cell Stem Cell. 19 (2), 258-265 (2016).
- Inak, G., et al. Defective metabolic programming impairs early neuronal morphogenesis in neural cultures and an organoid model of Leigh syndrome. Nat Commun. 12 (1), 1929 (2021).
- Karlsson, M., et al. A single-cell type transcriptomics map of human tissues. Sci Adv. 7 (31), eabh2169 (2021).
- Piwecka, M., Rajewsky, N., Rybak-Wolf, A. Single-cell and spatial transcriptomics: deciphering brain complexity in health and disease. Nat Rev Neurol. 19 (6), 346-362 (2023).
- Lim, B., Lin, Y., Navin, N. Advancing cancer research and medicine with single-cell genomics. Cancer Cell. 37 (4), 456-470 (2020).
- Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (51), 15672-15677 (2015).
- Fiorenzano, A., et al. Single-cell transcriptomics captures features of human midbrain development and dopamine neuron diversity in brain organoids. Nat Commun. 13 (1), 3312 (2022).
- Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
- Notaras, M., et al. Schizophrenia is defined by cell-specific neuropathology and multiple neurodevelopmental mechanisms in patient-derived cerebral organoids. Mol Psychiatry. 27 (3), 1416-1434 (2022).
- Rybak-Wolf, A., et al. Modelling viral encephalitis caused by herpes simplex virus 1 infection in cerebral organoids. Nat Microbiol. 8 (7), 1252-1266 (2023).
- Bock, C., et al. The organoid cell atlas. Nat Biotechnol. 39 (1), 13-17 (2021).
- Brazovskaja, A., Treutlein, B., Camp, J. G. High-throughput single-cell transcriptomics on organoids. Cur Opinion Biotechnol. 55, 167-171 (2019).
- Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570, 523-527 (2019).
- Uzquiano, A., et al. Proper acquisition of cell class identity in organoids allows definition of fate specification programs of the human cerebral cortex. Cell. 185 (20), 3770-3788.e27 (2022).
- Mattei, D., et al. Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations. Int J Mol Sci. 21 (21), 7944 (2020).
- Van Den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nat Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nat Med. 26 (5), 792-802 (2020).
- Santos, M. D., et al. Extraction and sequencing of single nuclei from murine skeletal muscles. STAR Protoc. 2 (3), 100694 (2021).
- Fleck, J. S., et al. Inferring and perturbing cell fate regulomes in human cerebral organoids. Nature. 621 (7978), 365-372 (2021).
- Martins-Costa, C., et al. Morphogenesis and development of human telencephalic organoids in the absence and presence of exogenous extracellular matrix. EMBO J. 42 (22), e113213 (2023).
- Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587.e29 (2021).
- Choe, M. S., et al. A simple method to improve the quality and yield of human pluripotent stem cell-derived cerebral organoids. Heliyon. 7 (6), e07350 (2021).
- Giandomenico, S. L., et al. Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output. Nat Neurosci. 22 (4), 669-679 (2019).
- Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130 (2020).
- Wen, F., Tang, X., Xu, L., Qu, H. Comparison of single-nucleus and single-cell transcriptomes in hepatocellular carcinoma tissue. Mol Med Rep. 26 (5), 339 (2022).
- Alles, J., et al. Cell fixation and preservation for droplet-based single-cell transcriptomics. BMC Biol. 15 (1), 44 (2017).
