Summary

Модель транзиторной окклюзии средней мозговой артерии при инсульте

Published: August 11, 2023
doi:

Summary

Данный протокол описывает модель транзиторной фокальной ишемии головного мозга у мышей через внутрипросветную окклюзию средней мозговой артерии. Кроме того, показаны примеры оценки результатов с использованием магнитно-резонансной томографии и поведенческих тестов.

Abstract

Инсульт является одной из основных причин смерти или хронической инвалидности во всем мире. Тем не менее, существующие оптимальные методы лечения ограничиваются реперфузионной терапией во время острой фазы ишемического инсульта. Для получения информации о физиопатологии инсульта и разработки инновационных терапевтических подходов фундаментальную роль играют модели инсульта у грызунов in vivo . Доступность генетически модифицированных животных особенно стимулировала использование мышей в качестве экспериментальных моделей инсульта.

У пациентов, перенесших инсульт, окклюзия средней мозговой артерии (МЦА) является распространенным явлением. Следовательно, наиболее распространенная экспериментальная модель включает внутрипросветную окклюзию MCA, минимально инвазивный метод, который не требует краниэктомии. Эта процедура включает в себя введение мононити через внешнюю сонную артерию (ЭКА) и продвижение ее через внутреннюю сонную артерию (ВСА) до тех пор, пока она не достигнет точки разветвления МКА. После 45-минутной артериальной окклюзии монофиламент удаляют для проведения реперфузии. На протяжении всего процесса контролируется мозговой кровоток для подтверждения уменьшения во время окклюзии и последующего восстановления после реперфузии. Неврологические и тканевые исходы оцениваются с помощью поведенческих тестов и магнитно-резонансной томографии (МРТ).

Introduction

По данным ВОЗ, инсульт является разрушительным заболеванием, от которого ежегодно страдают около 15 миллионов человек во всем мире. Около трети пациентов умирают от этого заболевания, в то время как другая треть испытывает постоянную инвалидность. Инсульт — это сложная патология, в которой участвуют различные типы клеток, такие как нейронные и периферические иммунные клетки, сосудистая сеть и системные реакции1. Сложная сеть реакций, вызванных инсультом на системном уровне, в настоящее время не может быть воспроизведена с помощью моделей in vitro . Таким образом, экспериментальные модели на животных необходимы для изучения механизмов заболевания, а также для разработки и тестирования новых методов лечения. В настоящее время ранняя тканевая реперфузия является единственным одобренным вмешательством, либо путем тромболизиса тканевым активатором плазминогена (tPA), либо путем эндоваскулярной тромбэктомии1.

Окклюзии средней мозговой артерии (МЦА) часто встречаются у пациентов, перенесших инсульт. В связи с этим на крысах 2,3,4 были первоначально разработаны модели транзиторной окклюзии MCA (tMCAo) на грызунах. В настоящее время генетически модифицированные мыши являются наиболее часто используемыми животными в экспериментальных моделях инсульта. В данном исследовании мы описываем минимально инвазивную модель внутрипросветного tMCAo у мышей. Доступ осуществляется через сонную артерию на уровне шеи, без краниэктомии.

Продолжительность окклюзионного периода является критическим фактором, определяющим степень ишемического поражения. Даже короткие окклюзии продолжительностью 10 минут могут вызвать селективную гибель нейронов без явного инфаркта, в то время как более длительные окклюзии, обычно длящиеся от 30 до 60 минут, приводят к некоторой степени инфаркта мозга. В отличие от проксимальной и дистальной ветвей MCA, которые снабжают кору головного мозга и имеют коллатерали, лентикуло-стриарные артерии, снабжающие кровью полосатое тело, не имеют коллатералей. Как следствие, после tMCAo происходит большее снижение кровотока в стриатуме, чем в коре. Таким образом, окклюзии продолжительностью 30 минут или менее обычно влияют на стриатум, но не на кору, в то время как более длительные окклюзии, начиная с 45 минут, часто приводят к ишемическому поражению всей территории MCA, включая стриатум и дорсолатеральную кору.

Чтобы обеспечить хорошее самочувствие мышей, перед процедурой мы вводим анальгетики и используем анестезию во время операции. Тем не менее, анестезия потенциально может внести искусственные изменения в физиологию мыши и повлиять на некоторые критерии исхода6. Хирургическое вмешательство, выполняемое опытным персоналом, обычно длится около 15 минут для индуцирования MCAo. В дальнейшем общее время под наркозом зависит от периода окклюзии. Для экспериментов, где минимизация анестезии имеет решающее значение, альтернативным этапом процедуры является прекращение анестезии в период окклюзии и ограничение ее только хирургическими этапами введения и извлечения нити, окклюзирующей MCA. Такой подход сокращает продолжительность анестезии и минимизирует ее потенциальное артефактное воздействие на экспериментальную модель 7,8. Таким образом, метод индуцирования транзиторной очаговой ишемии представлен внутрипросветной окклюзией МКА с двумя вариантами: с обезболиванием мыши в течение всего периода окклюзии или с бодрствованием мыши в этот период. В любом случае, параллельно с вмешательством, проводимым на ишемизированных мышах, должна быть проведена фиктивная операция. Кроме того, предоставляются данные об оценке исходов, измеренные с помощью поведенческих тестов и МРТ в различные моменты времени после реперфузии. Наконец, обсуждаются основные факторы, которые следует учитывать при реализации экспериментальной процедуры.

Protocol

Работа с животными проводилась в соответствии с законами Каталонии и Испании (Real Decreto 53/2013) и Европейскими директивами, с одобрения этического комитета (Comité Ètic d’Experimentació Animal, CEEA) Университета Барселоны и местных регулирующих органов Женералитата Каталонии. Результаты исследований публ…

Representative Results

Существуют различные подходы к оценке результатов процедуры tMCAo. Здесь используются методы нейровизуализации in vivo (МРТ) и поведенческое тестирование. У мышей развиваются ишемические поражения в головном мозге, в основном затрагивающие территорию, поставляемую MCA и?…

Discussion

Внутрипросветная процедура tMCAo является наиболее часто используемой моделью фокальной ишемии головного мозга с реперфузией в фундаментальных исследованиях. В настоящее время мыши являются предпочтительной животной моделью из-за наличия генетически модифицированных штаммов. Тем не …

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Исследование поддержано грантом PID2020-113202RB-I00, финансируемым Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN)/Agencia Estatal de Investigación (AEI), Gobierno de España/10.13039/501100011033 и «Европейским фондом регионального развития (ЕФРР). Способ сделать Европу». NCC и MAR получили стипендии (PRE2021-099481 и PRE2018-085737 соответственно), финансируемые MCIN/AEI/ 10.13039/501100011033 и «Европейским социальным фондом (ESF) Инвестиции в ваше будущее». Благодарим Франциску Руис-Хаэн и Леонардо Маркес-Кисиновски за техническую поддержку. Мы выражаем признательность за поддержку центра МРТ-визуализации Института биомедицинских исследований имени Августа Пи и Суньера (IDIBAPS). Программа Центров исследований Каталонии (CERCA) Женералитата Каталонии поддерживает IDIBAPS.

Materials

6/0 suture  Arago Vascular ligatures
6/0 suture with curved needle Arago Skin sutures
9 mg/mL Saline Fresenius Kabi CN616003 EC For hydration
Anaesthesia system SurgiVet
Blunt retractors, 1 mm wide Fine Science Tools 18200-09
Buprenorfine Buprex For pain relief
Clamp applying forceps Fine Science Tools S&T CAF4
Dumont mini forceps Fine Science Tools M3S 11200-10
Forceps Fine Science Tools 91106-12
Glue Loctite To stick LDF probe to the skull
Grip Strength Meter IITC Life Science Inc. #2200
Isoflurane B-Braun CN571105.8
LDF Perimed Perimed Periflux System 5000
LDF Probe Holders Perimed PH 07-4
Medical tape
MRI magnet Bruker BioSpin, Ettlingen, Germany BioSpec 70/30 horizontal animal scanner 
Needle Holder with Suture Cutter Fine Science Tools 12002-14
Nylon filament Doccol 701912PK5Re
Recovery cage with heating pad
Sirgical scissors Fine Science Tools 91401-12
Small vessel cauterizer kit Fine Science Tools 18000-00
Stereomicroscope and cold light Leica M60
Suture tying forceps Fine Science Tools 18025-10
Thermostat, rectal probe and mouse pad Letica Science Instruments LE 13206
Vannas spring scissors (4mm cutting edge) Fine Science Tools 15019-10
Vascular clamps Fine Science Tools 00396-01

Referencias

  1. Siddiqi, A. Z., Wadhwa, A. Treatment of acute stroke: current practices and future horizons. Cardiovascular Revascularization Medicine. 49, 56-65 (2023).
  2. Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 1, 53-60 (1981).
  3. Koizumi, J., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema. A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Japanese Journal of Stroke. 8, 1-8 (1986).
  4. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, R., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  5. Hossmann, K. A. Cerebral ischemia: Models, methods, and outcomes. Neuropharmacology. 55, 257-270 (2008).
  6. Seto, A., et al. Induction of ischemic stroke in awake freely moving mice reveals that isoflurane anesthesia can mask the benefits of a neuroprotection therapy. Frontiers in Neuroenergetics. 6, 1 (2014).
  7. Díaz-Marugan, L., et al. Poststroke lung infection by opportunistic commensal bacteria is not mediated by their expansion in the gut microbiota. Stroke. 54 (7), 1875-1887 (2023).
  8. Xie, L., Kang, H., Nedergaard, M. A novel model of transient occlusion of the middle cerebral artery in awake mice. Journal of Natural Sciences. 2 (2), e176 (2016).
  9. Arbaizar-Rovirosa, M., et al. Aged lipid-laden microglia display impaired responses to stroke. EMBO Molecular Medicine. 15 (2), e17175 (2023).
  10. Orsini, F., et al. Targeting mannose-binding lectin confers long-lasting protection with a surprisingly wide therapeutic window in cerebral ischemia. Circulation. 126 (12), 1484-1494 (2012).
  11. Majid, A., et al. Differences in vulnerability to permanent focal cerebral ischemia among 3 common mouse strains. Stroke. 31, 2707-2714 (2000).
  12. Rogers, D. C., Campbell, C. A., Stretton, J. L., Mackay, K. B. Correlation between motor impairment and infarct volume after permanent and transient middle cerebral artery occlusion in the rat. Stroke. 28, 2060-2065 (1997).
  13. Hedna, V. S., et al. Validity of Laser Doppler flowmetry in predicting outcome in murine intraluminal middle cerebral artery occlusion stroke. Journal of Vascular and Interventional Neurology. 8 (3), 74-82 (2015).
  14. Yin, L., et al. Laser speckle contrast imaging for blood flow monitoring in predicting outcomes after cerebral ischemia-reperfusion injury in mice. BMC Neuroscience. 23, 80 (2022).
  15. Thakkar, P. C., et al. Therapeutic relevance of elevated blood pressure after ischemic stroke in the hypertensive rats. Hypertension. 75 (3), 740-747 (2020).
  16. Yu, X., Feng, Y., Liu, R., Chen, Q. Hypothermia protects mice against ischemic stroke by modulating macrophage polarization through upregulation of interferon regulatory factor-4. Journal of Inflammation Research. 14, 1271-1281 (2021).
  17. Denorme, F., Portier, I., Kosaka, Y., Campbell, R. A. Hyperglycemia exacerbates ischemic stroke outcome independent of platelet glucose uptake. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 19, 536-546 (2021).

Play Video

Citar este artículo
Chaparro-Cabanillas, N., Arbaizar-Rovirosa, M., Salas-Perdomo, A., Gallizioli, M., Planas, A. M., Justicia, C. Transient Middle Cerebral Artery Occlusion Model of Stroke. J. Vis. Exp. (198), e65857, doi:10.3791/65857 (2023).

View Video