Summary

Verwendung von neuromuskulären Verbindungen und Muskelzellen von Drosophila-Larven zur Visualisierung des Mikrotubuli-Netzwerks

Published: October 20, 2023
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Summary

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Visualisierung der Mikrotubuli-Netzwerke in neuromuskulären Verbindungen und Muskelzellen vor. In Kombination mit den leistungsstarken genetischen Werkzeugen von Drosophila melanogaster erleichtert dieses Protokoll das genetische Screening und die Analyse der Mikrotubuli-Dynamik für die Rolle von Mikrotubuli-Netzwerk-regulatorischen Proteinen im Nervensystem erheblich.

Abstract

Das Mikrotubuli-Netzwerk ist ein wesentlicher Bestandteil des Nervensystems. Mutationen in vielen Mikrotubuli-regulatorischen Proteinen werden mit neurologischen Entwicklungsstörungen und neurologischen Erkrankungen in Verbindung gebracht, wie z. B. das Mikrotubuli-assoziierte Protein Tau zu neurodegenerativen Erkrankungen, Mikrotubuli-durchtrennende Proteine Spastin und Katanin 60 verursachen erbliche spastische Querschnittslähmung bzw. neurologische Entwicklungsstörungen. Der Nachweis von Mikrotubuli-Netzwerken in Neuronen ist vorteilhaft für die Aufklärung der Pathogenese neurologischer Erkrankungen. Die geringe Größe der Neuronen und die dichte Anordnung der axonalen Mikrotubuli-Bündel machen die Visualisierung der Mikrotubuli-Netzwerke jedoch schwierig. In dieser Arbeit beschreiben wir eine Methode zur Dissektion der neuromuskulären Verbindungen und Muskelzellen der Larve sowie zur Immunfärbung von α-Tubulin und dem Mikrotubuli-assoziierten Protein Futsch zur Visualisierung von Mikrotubuli-Netzwerken in Drosophila melanogaster. Die neuromuskuläre Verbindung ermöglicht es uns, sowohl prä- als auch postsynaptische Mikrotubuli zu beobachten, und die Größe der Muskelzellen in der Drosophila-Larve ermöglicht eine klare Visualisierung des Mikrotubuli-Netzwerks. Durch die Mutation und Überexpression von Katanin 60 in Drosophila melanogaster und die anschließende Untersuchung der Mikrotubuli-Netzwerke in der neuromuskulären Verbindung und den Muskelzellen zeigen wir die regulatorische Rolle von Katanin 60 in der Neuroentwicklung genau auf. In Kombination mit den leistungsstarken genetischen Werkzeugen von Drosophila melanogaster erleichtert dieses Protokoll daher das genetische Screening und die Analyse der Mikrotubuli-Dynamik für die Rolle von Mikrotubuli-Netzwerk-regulatorischen Proteinen im Nervensystem erheblich.

Introduction

Mikrotubuli (MTs) spielen als einer der strukturellen Bestandteile des Zytoskeletts eine wichtige Rolle bei verschiedenen biologischen Prozessen, darunter Zellteilung, Zellwachstum und -motilität, intrazellulärer Transport und die Aufrechterhaltung der Zellform. Die Dynamik und Funktion der Mikrotubuli wird durch Wechselwirkungen mit anderen Proteinen wie MAP1, MAP2, Tau, Katanin und Kinesin 1,2,3,4,5 moduliert.

In Neuronen sind Mikrotubuli essentiell für die Entwicklung und Aufrechterhaltung von Axonen und Dendriten. Anomalien in den Mikrotubuli führen zu Funktionsstörungen und sogar zum Absterben von Neuronen. Im Gehirn von Alzheimer-Patienten verringert beispielsweise die Hyperphosphorylierung des Tau-Proteins die Stabilität des Mikrotubuli-Netzwerks, was zu neurologischen Unregelmäßigkeiten führt6. Die Untersuchung von Mikrotubuli-Netzwerken wird somit zum Verständnis der neuronalen Entwicklung und der Pathogenese neurologischer Erkrankungen beitragen.

Die neuromuskuläre Verbindung (NMJ) ist die periphere Synapse, die zwischen einem Axonterminal des Motoneurons und einer Muskelfaser gebildet wird, was ein hervorragendes und leistungsfähiges Modellsystem für die Untersuchung der synaptischen Struktur und Funktionen darstellt7. Futsch ist ein Protein in Drosophila, das homolog zum Mikrotubuli-bindenden Protein MAP1B ist, das in Säugetieren vorkommt8. Es wird nur in Neuronen exprimiert und spielt eine Rolle bei der Entwicklung der synaptischen Knöpfe des NMJ 8,9. Im Wildtyp werden filamentöse Bündel, die entlang des Zentrums von NMJ-Prozessen verlaufen, durch Immunfärbung mit Anti-Futsch sichtbar gemacht. Wenn dieses Bündel das Ende von NMJ erreicht, hat es die Fähigkeit, entweder eine Schleife aus Mikrotubuli zu bilden oder seine filamentöse Struktur zu verlieren, was zu einem diffusen und punktförmigen Erscheinungsbild führt10. Mikrotubuli-Schleifen sind mit pausierten Wachstumskegeln assoziiert, was darauf hindeutet, dass das Mikrotubuli-Array stabil ist11. Daher können wir indirekt die stabile Mikrotubuli-Entwicklung im NMJ durch Futsch-Färbung bestimmen. Die Größe der Muskelzellen in der Drosophila-Larve ermöglicht eine klare Visualisierung des Mikrotubuli-Netzwerks. Die Faktoren, die die Stabilität des Mikrotubuli-Netzwerks beeinflussen, können durch die Analyse der Dichte und Form der Mikrotubuli ermittelt werden. Gleichzeitig kann der Status des Mikrotubuli-Netzwerks von Muskelzellen mit dem Ergebnis der NMJ abgeglichen werden, um umfassendere Schlussfolgerungen zu erhalten.

Viele Protokolle wurden verwendet, um das Netzwerk und die Dynamik von Mikrotubuli zu untersuchen. Diese Forschungen konzentrierten sich jedoch häufig auf In-vitro-Studien 12,13,14,15,16. Alternativ wurden in einigen In-vivo-Experimenten Elektronenmikroskopie eingesetzt, um das Zytoskelett zu detektieren17. Entsprechend der spezifischen Bindung von fluoreszenzmarkierten Antikörpern oder chemischen Farbstoffen an Proteine oder DNA erlauben die hier vorgestellten Methoden den Nachweis von Mikrotubuli-Netzwerken im NMJ auf der Ebene einzelner Neuronen in vivo, wobei die Ergebnisse durch Beobachtungen in Muskelzellen bestätigt werden. Dieses Protokoll ist einfach, stabil und wiederholbar, wenn es mit den leistungsstarken genetischen Werkzeugen kombiniert wird, die in Drosophila melanogaster verfügbar sind, und ermöglicht eine Vielzahl von phänotypischen Untersuchungen und genetischen Screenings für die Rolle von Mikrotubuli-Netzwerk-regulatorischen Proteinen im Nervensystem in vivo.

Protocol

1. Sektion der Larven HINWEIS: Die Präparierlösung Hämolymph-ähnliche Kochsalzlösung (HL3.1)18 und die Fixierlösung 4% Paraformaldehyd (PFA)19,20 werden bei Raumtemperatur verwendet, da die Mikrotubuli bei zu niedriger Temperatur depolymerisieren. Suchen Sie sich eine wandernde Larve des 3. Instars mit einer langen, stumpfen Zange aus. Waschen Sie es mit HL3.1 und lege…

Representative Results

Wir demonstrierten ein Schritt-für-Schritt-Verfahren zur Visualisierung des Mikrotubuli-Netzwerks sowohl in neuromuskulären Verbindungen (NMJs) als auch in Muskelzellen. Nach der Dissektion gemäß dem schematischen Diagramm (Abbildung 1A-E) wird eine Immunfärbung durchgeführt, und anschließend werden die Bilder unter einem konfokalen Lasermikroskop oder einem stereoskopischen Fluoreszenzmikroskop beobachtet und gesammelt (Abbildung 1F,G).<strong class=…

Discussion

Hier wird ein Protokoll für die Dissektion und Immunfärbung von neuromuskulären Verbindungen und Muskelzellen von Drosophila-Larven beschrieben. Es gibt mehrere wesentliche Punkte zu beachten. Erstens ist es entscheidend, Verletzungen der beobachteten Muskeln während des Sezierprozesses zu vermeiden. Es kann sich lohnen, das Filet vor der Entfernung der inneren Organe zu fixieren, um einen direkten Kontakt zwischen der Zange und den Muskeln zu verhindern. Um Muskelschäden oder eine Trennung von der Epidermi…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Dr. Ying Xiong für die Diskussionen und Kommentare zum Manuskript. Diese Arbeit wird durch ein Stipendium der National Science Foundation of China (NSFC) an C. M. (31500839) unterstützt.

Materials

Alexa Fluor Plus 405 phalloidin invitrogen A30104 dilute 1:200
Enhanced Antifade Mounting Medium Beyotime P0128M
FV10-ASW confocal microscope Olympus
Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated Thermo Fisher A-11001 dilute 1:1,000
Laser confocal microscope LSM 710 Zeiss
Micro Scissors 66vision 54138B
Mouse anti-Futsch antibody Developmental Studies Hybridoma Bank   22C10 dilute 1:50
Mouse anti-α-tubulin antibody Sigma T5168 dilute 1:1,000
Paraformaldehyde Wako 168-20955 Final concentration: 4% in PB Buffer
Stainless Steel Minutien Pins Entomoravia 0.1mm Diam
Stereomicroscope SMZ161 Motic
stereoscopic fluorescence microscope BX41 Olympus
Texas Red-conjugated goat anti-HRP Jackson ImmunoResearch dilute 1:100
TO-PRO(R) 3 iodide Invitrogen T3605 dilute 1:1,000
Transfer decoloring shaker TS-8 Kylin-Bell lab instruments E0018
TritonX-100 BioFroxx 1139
Tweezers  dumont 500342

Referencias

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Zhang, S., Wang, X., Liu, Z., Jin, S., Mao, C. Using Drosophila Larval Neuromuscular Junction and Muscle Cells to Visualize Microtubule Network. J. Vis. Exp. (200), e65774, doi:10.3791/65774 (2023).

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