Summary

인간 말초 혈액 단핵 세포의 냉동 보존 및 생체 에너지 평가

Published: October 20, 2023
doi:

Summary

분리된 말초 혈액 단핵 세포는 면역 기능 및 장애, 대사 질환 또는 미토콘드리아 기능의 분석에 사용할 수 있습니다. 이 연구에서는 전혈에서 PBMC를 준비하고 후속 냉동 보존을 위한 표준화된 방법을 설명합니다. 냉동 보존은 이 시간과 장소를 독립적으로 만듭니다.

Abstract

진핵 세포의 생리적 기능은 주로 미토콘드리아가 제공하는 에너지에 의존합니다. 미토콘드리아 기능 장애는 대사 질환 및 노화와 관련이 있습니다. 산화적 인산화는 에너지 항상성 유지에 중요하기 때문에 결정적인 역할을 합니다. PBMC는 미토콘드리아 기능을 측정하기 위한 최소 침습 샘플로 확인되었으며 질병 상태를 반영하는 것으로 나타났습니다. 그러나 미토콘드리아 생체 에너지 기능의 측정은 인간 샘플의 여러 요인에 의해 제한될 수 있습니다. 제한 사항은 채취한 샘플의 양, 종종 며칠에 걸쳐 분산되는 샘플링 시간 및 위치입니다. 수집된 샘플의 냉동 보존은 샘플의 일관된 수집 및 측정을 보장할 수 있습니다. 측정된 매개변수가 냉동 보존된 세포와 새로 준비된 세포 간에 비교할 수 있도록 주의해야 합니다. 여기에서는 이러한 세포에서 미토콘드리아의 생체 에너지 기능을 분석하기 위해 인간 혈액 샘플에서 PBMC를 분리하고 냉동 보존하는 방법을 설명합니다. 여기에 설명된 프로토콜에 따라 동결 보존된 PBMC는 갓 수확한 세포와 비교하여 세포 수 및 생존력, 아데노신 삼인산 수치 및 측정된 호흡 사슬 활성에서 약간의 차이만 보여줍니다. 설명된 제제에는 8-24mL의 인간 혈액만 필요하므로 임상 연구 중에 다중앙에서 샘플을 수집하고 현장에서 생체 에너지를 측정할 수 있습니다.

Introduction

인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 노화 과정이나 퇴행성 질환과 관련된 면역 및 생체 에너지 문제 연구를 포함하여 많은 과학 분야의 다양한 응용 분야에 사용됩니다 1,2. PBMC는 구성이 이질적이며 림프구(B 세포, T 세포 및 NK 세포), 단핵구 및 수지상 세포로 구성됩니다. 세포는 때때로 피험자 내에서 큰 개인차와 편차를 보이기 때문에 이러한 세포를 다루기 위한 표준화된 절차가 필요합니다. 분리물의 생존력 및 순도와 같은 중요한 매개변수는 취급을 위한 기본 요구 사항이며 수집 시간, 멜라토닌 수치, 피험자의 공복 여부 등과 같은 환경 요인의 영향을 추가로 받습니다 3,4.

PBMC의 생체 에너지학에 대한 연구를 바탕으로 여기서는 다른 방법에도 적합한 PBMC의 분리, 동결 보존 및 배양 방법을 설명합니다. 근육 생검은 미토콘드리아 에너지 대사의 황금 표준으로 간주되지만5 혈액 세포 검사는 빠르고 최소 침습적인 절차입니다. 이 외에도 점점 더 많은 연구에서 노화와 알츠하이머병(AD)의 미토콘드리아 기능 변화가 뇌뿐만 아니라 말초에서도 발생한다는 것을 시사합니다 6,7,8,9,10. 이 방법은 또한 당뇨병 및 비만을 포함한 다른 상태 및 질병에 대한 조사를 가능하게 한다 11,12,13. 다발성 경화증 환자의 유전자 발현 패턴은 일반적으로 면역 기능 및 영향을 분석할 수 있습니다 14,15,16.

PBMC는 일반적으로 산화적 인산화(OXPHOS)에 의존하여 아데노신 삼인산(ATP)17,18을 생성합니다. 따라서 PBMC는 대리자로서 광범위한 응용 분야를 포괄합니다. 이전 보고에서, PBMC의 에너지 대사는 미토콘드리아 기능의 초기 심부전19, 패혈성 쇼크20 또는 성별 관련 차이4와 같은 장기 기능 장애를 해결하는 데 사용되었다. PBMC의 동결 보존 분리 및 배양을 위한 일반화된 방법은 다른 기관에서 얻은 결과의 비교 가능성에 이점이 있습니다. 각 단계(21,22)에 대한 프로토콜에는 많은 변이가 있으며, 이 방법의 목표는 PBMC에서 생체 에너지 측정에 대한 지침을 제공하는 것이다.

이 기사에서는 PBMC에서 생체 에너지 파라미터를 측정하는 방법에 대해 설명합니다. 인간 혈액에서 PBMC의 생체 에너지를 분리, 동결 보존 및 측정하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 환자의 생체 에너지 매개변수를 결정하고 임상 맥락에서 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 측정을 적용하기 위해 연구자들은 신선한 혈액 샘플을 얻을 수 있는 환자 집단에 접근할 수 있어야 합니다.

Protocol

이 원고에 설명된 혈액 수집, 분리 및 분석에 대한 모든 프로토콜은 독일 기센 대학의 기관 검토 위원회에서 검토 및 승인했습니다. 연구에 샘플을 포함하는 것에 대한 환자의 동의를 얻었습니다. 분리 및 세포 배양을 위한 모든 단계는 생물 안전 작업대에서 수행됩니다. 1. 정맥 천자 소독 스프레이, 멸균 면봉, 80mm 튜브 및 다중 어댑터가 있는 채혈 캐뉼라,…

Representative Results

세포 생존율 및 수성공적인 분리 및 동결 보존을 달성하려면 세포 수와 생존율이 최대한 높아야 합니다. 냉동 보존 전후에 세포를 계수하고 세포의 건강과 품질을 보장하기 위해 생존율을 결정합니다. 그림 3 은 냉동 보존 전과 후의 PBMC를 대표적으로 나타낸 것으로, 세포 수와 생존율은 거의 차이가 없습니다. 이는 PBMC의 성공적인 격리 및 보존을 나타냅니다….

Discussion

이 프로토콜은 생체 에너지 분석에 적합한 방식으로 인간 혈액에서 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 분리하고 동결 보존하는 수단을 제공합니다. 설명된 방법은 PBMC를 부드럽게 대량으로 분리할 수 있는 가능성을 제공하며, 높은 생존율과 생체 에너지 측정을 위한 충분한 세포를 제공합니다. 최소한의 중단에도 긴 분리가 발생하지만 후속 동결 보존을 통해 생체 에너지학의 시간 독립적인 측정이 가능…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

혈액 채취에 대해 Giessen-Marburg 대학병원의 임상팀에 감사드립니다. 이 작업은 Justus Liebig 대학에서 자금을 지원했습니다.

Materials

0.1 M Triethanolamine-HCl-Buffer (pH = 8,0) Self-prepared
0.5 M Triethanolamine-HCl-Buffer Self-prepared
1.0 M Tris-HCl-Buffer (pH = 8,1) Self-prepared
1.01 mM DTBB Self-prepared
10 % Triton X-100 Self-prepared
10 mM Oxalacetat Self-prepared
14–20 G sterile blood draw needles Multi Adapter Sarstedt Safety-Multifly Sarstedt 156353_v
37% HCl Carl Roth GmbH & Co. KG
70% Ethanol (EtOH) Self-prepared
Acetyl-CoA Pancreac Applichem A3753
ADP Sigma-Aldrich A5285
Alcohol wipes  (70% isopropyl alcohol)
Antimycin A Sigma-Aldrich A8674
Aqua (bidest.) With MilliQ Academic (self-made)
Ascorbate Sigma-Aldrich A4034
ATP-Standard Sigma-Aldrich 6016949
Biocoll Seperating Solution Biochrom 6115
Biological safty cabinet MSC Advantage Thermo Fisher Scientific Inc.
Carbonylcyanid-p-trifluoromethoxy-phenylhydrazon (FCCP) Sigma-Aldrich C2920
Cell counter TC20 Automated Cell Counter Bio-Rad
Centrifuge Heraeus Megafuge 16 R Thermo Fisher Scientific Inc.
Counting slides, dual chamber for cell counter Bio-Rad 1450016
Cryotube Cryo.S Grainer Bio-One 126263-2DG
Digitonin Sigma-Aldrich 37008
Dimethylsulfoxid (DMSO) Merck 102952
Disinfection spray
Disposable gloves latex, rubber, or vinyl.
Distrips (12.5 ml) DistriTips Gilson F164150
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS; 10x) Gibco (Thermo Scientific) 15217168
Ethanol (EtOH 100%) Carl ROTH GmbH & Co. KG 9065.3
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F9665
Frezer (-80°C) Thermo Fisher Scientific Inc.
Glutamate Sigma-Aldrich G1626
Holder/adapter 
Incubator Midi 40 CO2 Thermo Fisher Scientific Inc.
Injection syringe Hamilton
Malate Sigma-Aldrich M-1000
MIR05 Self-prepared
Mr. Frosty Freezing Container Thermo Fisher Scientific Inc. 10110051
Multireader CLARIOstar BMG Labtech
Nitrogen tank Locator 6 plus Thermo Fisher Scientific Inc.
Oligomycin Sigma-Aldrich O4876
Oxalacetate Sigma-Aldrich
Oxygraph-2k Orobororus Instruments
Penicillin-Streptomycin PAA 15140122
Pipettes Performance Pipettor 10 μL, 100 μL, 1000 μL VWR
Roswell-Park. Memorial-Institute-Medium (RPMI-1640) Gibco (Thermo Scientific) 11530586
Rotenone Sigma-Aldrich R8875
Saccharose Carl ROTH GmbH & Co. KG 9286.2
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002
Succinate Sigma-Aldrich S2378
Tetramethylphenylendiamin (TMPD) Sigma-Aldrich T3134
Tourniquet/ Blood pressure cuff
Tris(hydroxymethyl)amino-methane Sigma-Aldrich 108382
Triton X-100 Sigma-Aldrich 108643
Trypanblau Biochrom T6146
Vacuum pump Vaccubrand GmbH & Co.
ViewPlate-96 Perkin Elmer 6005181
Water bath WNB22 Memmert GmbH & Co. KG

Referencias

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Dieter, F., Grube, J., Birkenhauer, T., Quentin, A., Eckert, G. P. Cryopreservation and Bioenergetic Evaluation of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells. J. Vis. Exp. (200), e65730, doi:10.3791/65730 (2023).

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