Summary

Virus pseudotipizzati come strumento molecolare per monitorare le risposte immunitarie umorali contro SARS-CoV-2 tramite test di neutralizzazione

Published: November 21, 2023
doi:

Summary

I virus pseudotipizzati (PV) sono virioni difettosi di replicazione che vengono utilizzati per studiare le interazioni ospite-virus in condizioni più sicure rispetto alla manipolazione di virus autentici. Di seguito è presentato un protocollo dettagliato che mostra come i PV SARS-CoV-2 possono essere utilizzati per testare la capacità neutralizzante del siero dei pazienti dopo la vaccinazione COVID-19.

Abstract

I virus pseudotipizzati (PV) sono strumenti molecolari che possono essere utilizzati per studiare le interazioni ospite-virus e per testare la capacità neutralizzante di campioni di siero, oltre al loro uso più noto nella terapia genica per la veicolazione di un gene di interesse. I PV sono difettosi di replicazione perché il genoma virale è diviso in diversi plasmidi che non sono incorporati nei PV. Questo sistema sicuro e versatile consente l’uso di PV in laboratori di livello di biosicurezza 2. Qui, presentiamo una metodologia generale per produrre PV lentivirali basata su tre plasmidi come menzionato qui: (1) il plasmide della spina dorsale che trasporta il gene reporter necessario per monitorare l’infezione; (2) il plasmide impacchettatore che trasporta i geni per tutte le proteine strutturali necessarie per generare le PVs; (3) il plasmide di espressione della glicoproteina superficiale dell’involucro che determina il trofismo del virus e media l’ingresso virale nella cellula ospite. In questo lavoro, SARS-CoV-2 Spike è la glicoproteina dell’involucro utilizzata per la produzione di lentivirus pseudotipizzati SARS-CoV-2 non replicati.

In breve, le cellule di impacchettamento (HEK293T) sono state co-trasfettate con i tre diversi plasmidi utilizzando metodi standard. Dopo 48 ore, il surnatante contenente i PV è stato raccolto, filtrato e conservato a -80 °C. L’infettività dei PV di SARS-CoV-2 è stata testata studiando l’espressione del gene reporter (luciferasi) in una linea cellulare bersaglio 48 ore dopo l’infezione. Maggiore è il valore delle unità di luminescenza relativa (RLU), maggiore è il tasso di infezione/trasduzione. Inoltre, i PV infettivi sono stati aggiunti ai campioni di siero diluiti in serie per studiare il processo di neutralizzazione dell’ingresso degli pseudovirus nelle cellule bersaglio, misurato come riduzione dell’intensità dell’RLU: valori più bassi corrispondenti a un’elevata attività neutralizzante.

Introduction

I virus pseudotipizzati (PV) sono strumenti molecolari utilizzati in microbiologia per studiare le interazioni ospite-virus e patogeno-patogeno 1,2,3,4. I PV sono costituiti da una parte interna, il nucleo virale che protegge il genoma virale, e da una parte esterna, le glicoproteine dell’involucro sulla superficie del virus che definisce il tropismo5. Uno pseudovirus è incompetente nella replicazione della cellula bersaglio perché non contiene tutte le informazioni genetiche per generare nuove particelle virali. Questa combinazione di caratteristiche peculiari rende i PV un’alternativa sicura a un virus wildtype. I virus wildtype, d’altra parte, sono altamente patogeni e non possono essere utilizzati nei laboratori BSL 2 per l’analisi6.

L’infettività delle PV può essere monitorata da un gene reporter, di solito codificante per una proteina fluorescente (GFP, RFP, YFP) o un enzima che produce prodotti chemiluminescenti (luciferasi). Questo è contenuto in uno dei plasmidi utilizzati per la produzione di PV e incorporato nel genoma dello pseudovirus7.

Attualmente esistono diversi tipi di nuclei fotovoltaici, comprese le particelle derivate da lentivirali basate sul genoma dell’HIV-1. Il grande vantaggio dei PV basati sull’HIV-1 rispetto ad altre piattaforme è il loro intrinseco processo di integrazione nel genoma della cellula bersaglio8. Sebbene l’HIV-1 sia un virus altamente contagioso e sia l’agente eziologico dell’AIDS, questi vettori lentivirali sono sicuri da usare grazie alle ampie fasi di ottimizzazione nel corso degli anni. Condizioni ottimali di sicurezza sono state raggiunte con l’introduzione di vettori lentivirali di seconda generazione, in cui i geni virali sono stati impoveriti senza influenzare le capacità di trasduzione9. La 3ae la 4a generazione hanno contribuito ad aumentare la sicurezza della manipolazione dei vettori lentivirali con l’ulteriore suddivisione del genoma virale in plasmidi separati10,11. Le ultime generazioni di PV sono generalmente impiegate per produrre vettori lentivirali per la terapia genica.

I PV possono essere utilizzati per studiare le interazioni tra virus e cellule ospiti, sia durante la fase di produzione che durante la fase di infezione. I PV sono particolarmente impiegati nei saggi di neutralizzazione degli pseudovirus (PVNA). I PVNA sono ampiamente validati per valutare il potenziale di neutralizzazione del siero o del plasma prendendo di mira la glicoproteina virale sull’involucro12,13 del PV. L’attività di neutralizzazione, espressa come concentrazione inibitoria 50 (IC50), è definita come la diluizione del siero/plasma che blocca il 50% dell’ingresso delle particelle virali14. In questo protocollo, abbiamo descritto la messa a punto di un PVNA per testare l’attività anticorpale contro la Sindrome Respiratoria Acuta Grave – Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) in sieri raccolti prima e dopo aver ricevuto una dose di vaccino di richiamo.

Protocol

Il presente protocollo è stato approvato e segue le linee guida del Comitato Etico dell’Università di Verona (protocollo di approvazione numero 1538). Il consenso scritto informato è stato ottenuto dai soggetti umani che hanno partecipato allo studio. I campioni di sangue intero sono stati raccolti da volontari operatori sanitari (HCW) che erano in procinto di ricevere vaccini anti-SARS-CoV-2. Questi campioni sono stati raccolti in provette di plastica contenenti anticoagulanti per il successivo isolamento del siero<s…

Representative Results

Questo protocollo descrive la produzione di PV di SARS-CoV-2 e un’applicazione a valle di questi PV per analizzare l’attività di neutralizzazione del siero/plasma di soggetti sottoposti a vaccinazione anti-COVID-1917. Inoltre, questo protocollo può essere applicato per produrre pseudotipi di ciascuna variante di SARS-CoV-2 che desta preoccupazione (VOC) per testare l’evoluzione della risposta neutralizzante. Nonostante questo protocollo faciliti lo studio della risposta immunitaria umorale dopo …

Discussion

Sebbene l’utilizzo di un virus wildtype simuli l’infezione effettiva, i PV lentivirali sono un’opzione più sicura per studiare i meccanismi associati all’ingresso e all’infezione virale senza i severi requisiti di sicurezza necessari per lavorare con i virus patogeni 4,20,21. I PV sono composti da un nucleo virale difettoso di replicazione circondato dalla glicoproteina dell’involucro superficiale di un virus patogeno che è l’…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Riconosciamo il contributo dei volontari degli operatori sanitari. Questo progetto è stato sostenuto dal Dipartimento di Eccellenza 2023/2027, MUR, Italia. AR e DZ sono stati sostenuti da PRIN2022 (finanziamenti dell’UE; NextGenerationEU)

Materials

0.45 μm filter SARSTEDT 83 1826
6-well plate SARSTEDT 83 3920
96-well plate SARSTEDT 8,33,924
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units Merck 10403892
Black Opaque 96-well Microplate Perkin Elmer 60005270
Dulbecco's Modified Eagle Medium  SIGMA-ALDRICH D6546 – 500ML
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS 1x) AUROGENE AU-L0615-500
Foetal Bovine Serum AUROGENE AU-S1810-500
Graphpad Prism version 7 graphpad dotmatics NA In the manuscript, we replace the commercial name with 'data analysis program'
HEK293T cells ATCC CRL-3216
HEK293T/ACE2 cells ATCC CRL-3216 HEK293T has been transduced to overexpress ACE2 with a lentiviral vector.
L-glutamine  AUROGENE AU-X0550-100
Luminometer – Victor3 Perkin Elmer HH35000500 In the manuscript, we replace the commercial name with  'luminometer' 
Opti-MEM Thermo Fisher Scientific 11058021 In the manuscript, we replace the commercial name with 'reduced serum medium' 
p8.91 packaging plasmid Di Genova et al., 2021 A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.)
pCSFLW reporter plasmid Di Genova et al., 2021 A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.)
Penicillin/streptomycin AUROGENE AU-L0022-100
Polyethylenimine, branched (PEI) (25 kDa) SIGMA-ALDRICH 408727
RRL.sin.cPPT.SFFV/Ace2.IRES-puro.WPRE (MT126) Addgene 145839 This plasmid was used to generate HEK293Tcells/ACE2
SARS-CoV-2 Spike expressing plasmid Addgene pGBW-m4137382
steadylite plus Reporter Gene Assay System Perkin Elmer 6066759 In the manuscript, we replaced the commercial name with 'luciferase reading reagent'
Trypsin EDTA 1x AUROGENE AU-L0949-100

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Fantoni, T., Bissoli, M., Stefani, C., Voi, M., Dabija, A., Casula, R., Minafra, D. L., da Fonseca Palmeira, J., Argañaraz, E. R., Mayora-Neto, M., Temperton, N. J., Zipeto, D., Ruggiero, A. Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay. J. Vis. Exp. (201), e65658, doi:10.3791/65658 (2023).

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