Pseudotypede virus som et molekylært verktøy for å overvåke humorale immunresponser mot SARS-CoV-2 via nøytraliseringsanalyse
Summary
Pseudotypede virus (PVer) er replikasjonsdefekte virioner som brukes til å studere vertsvirusinteraksjoner under tryggere forhold enn å håndtere autentiske virus. Presentert her er en detaljert protokoll som viser hvordan SARS-CoV-2 PV-er kan brukes til å teste nøytraliseringsevnen til pasienters serum etter COVID-19-vaksinasjon.
Abstract
Pseudotypede virus (PV) er molekylære verktøy som kan brukes til å studere vertsvirusinteraksjoner og for å teste serumprøvers nøytraliserende evne, i tillegg til deres bedre kjente bruk i genterapi for levering av et gen av interesse. PV er replikasjonsdefekt fordi virusgenomet er delt inn i forskjellige plasmider som ikke er innlemmet i PVene. Dette sikre og allsidige systemet tillater bruk av PV i biosikkerhetsnivå 2-laboratorier. Her presenterer vi en generell metodikk for å produsere lentivirale PV basert på tre plasmider som nevnt her: (1) ryggradsplasmidet som bærer reportergenet som trengs for å overvåke infeksjonen; (2) emballasjeplasmidet som bærer genene for alle strukturelle proteiner som trengs for å generere PVene; (3) konvoluttoverflaten glykoprotein ekspresjonsplasmid som bestemmer virustropisme og medierer viral inngang i vertscellen. I dette arbeidet er SARS-CoV-2 Spike konvoluttglykoproteinet som brukes til produksjon av ikke-replikerende SARS-CoV-2 pseudotype lentivirus.
Kort fortalt ble pakkeceller (HEK293T) samtransfektet med de tre forskjellige plasmidene ved hjelp av standardmetoder. Etter 48 timer ble supernatanten som inneholdt PV-ene høstet, filtrert og lagret ved -80 °C. Smittsomheten til SARS-CoV-2 PV ble testet ved å studere ekspresjonen av reportergenet (luciferase) i en målcellelinje 48 timer etter infeksjon. Jo høyere verdien er for relative luminescensenheter (RLU), desto høyere er infeksjons-/transduksjonsraten. Videre ble de smittsomme PVene tilsatt de serielt fortynnede serumprøvene for å studere nøytraliseringsprosessen av pseudovirusets inntreden i målceller, målt som reduksjonen i RLU-intensitet: lavere verdier tilsvarende høy nøytraliserende aktivitet.
Introduction
Pseudotypede virus (PV) er molekylære verktøy som brukes i mikrobiologi for å studere vertsvirus og patogen-patogen-interaksjoner 1,2,3,4. PV består av en indre del, den virale kjernen som beskytter virusgenomet, og en ytre del, konvoluttglykoproteinene på overflaten av viruset som definerer tropismen5. Et pseudovirus er replikasjonsinkompetent i målcellen fordi det ikke inneholder all genetisk informasjon for å generere nye viruspartikler. Denne kombinasjonen av særegne egenskaper gjør PV-er til et trygt alternativ til et villtypevirus. Wildtype-virus er derimot høypatogene og kan ikke brukes i BSL 2-laboratorier for analyse6.
Smittsomheten til PV kan overvåkes av et reportergen, som vanligvis koder for et fluorescerende protein (GFP, RFP, YFP) eller et enzym som produserer kjemiluminescerende produkter (luciferase). Dette er inneholdt i et av plasmidene som brukes til PV-produksjon og innlemmet i genomet til pseudovirus7.
Flere typer PV-kjerner eksisterer for tiden, inkludert lentiviral-avledede partikler basert på HIV-1-genomet. Den store fordelen med HIV-1-baserte PV over andre plattformer er deres iboende integrasjonsprosess i målcellegenomet8. Selv om HIV-1 er et svært smittsomt virus og er årsaken til AIDS, er disse lentivirale vektorene trygge å bruke på grunn av de omfattende optimaliseringstrinnene gjennom årene. Optimale sikkerhetsforhold ble oppnådd ved innføring av 2. generasjons lentivirale vektorer, hvor virusgener ble utarmet uten å påvirke transduksjonsevnen9. 3. og 4. generasjon bidro til økt sikkerhet ved lentiviral vektorhåndtering med ytterligere spalting av virusgenomet i separate plasmider10,11. De siste generasjonene av PV er vanligvis ansatt for å produsere lentivirale vektorer for genterapi.
PV kan brukes til å studere interaksjoner mellom virus og vertsceller, både under produksjons- og infeksjonsfasen. PV er spesielt ansatt i pseudovirus nøytralisering analyser (PVNA). PVNA er allment validert for å vurdere nøytraliseringspotensialet til serum eller plasma ved å målrette det virale glykoproteinet på PVs konvolutt12,13. Nøytraliseringsaktivitet, uttrykt som den hemmende konsentrasjonen 50 (IC50), er definert som fortynning av serum / plasma som blokkerer 50% av viral partikkelinngang14. I denne protokollen beskrev vi oppsett av PVNA for å teste antistoffaktiviteten mot Severe Acute Respiratory Syndrome – Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) i sera samlet inn før og etter oppfriskningsvaksinedose.
Protocol
Representative Results
Discussion
Selv om bruk av et villtypevirus simulerer den faktiske infeksjonen, er lentivirale PV et tryggere alternativ for å studere mekanismene forbundet med viral oppføring og infeksjon uten de strenge sikkerhetskravene som er nødvendige for å arbeide med patogene virus 4,20,21. PV er sammensatt av en replikasjonsdefekt viral kjerne omgitt av overflatekonvoluttglykoprotein av et patogent virus, som er målet med studien.
<p cla…Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi anerkjenner bidraget fra de frivillige helsearbeiderne. Dette prosjektet ble støttet av Department of Excellence 2023/2027, MUR, Italia. AR og DZ ble støttet av PRIN2022 (EU-midler; NextGenerationEU)
Materials
| 0.45 μm filter | SARSTEDT | 83 1826 | |
| 6-well plate | SARSTEDT | 83 3920 | |
| 96-well plate | SARSTEDT | 8,33,924 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Merck | 10403892 | |
| Black Opaque 96-well Microplate | Perkin Elmer | 60005270 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | SIGMA-ALDRICH | D6546 – 500ML | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS 1x) | AUROGENE | AU-L0615-500 | |
| Foetal Bovine Serum | AUROGENE | AU-S1810-500 | |
| Graphpad Prism version 7 | graphpad dotmatics | NA | In the manuscript, we replace the commercial name with 'data analysis program' |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| HEK293T/ACE2 cells | ATCC | CRL-3216 | HEK293T has been transduced to overexpress ACE2 with a lentiviral vector. |
| L-glutamine | AUROGENE | AU-X0550-100 | |
| Luminometer – Victor3 | Perkin Elmer | HH35000500 | In the manuscript, we replace the commercial name with 'luminometer' |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | In the manuscript, we replace the commercial name with 'reduced serum medium' |
| p8.91 packaging plasmid | Di Genova et al., 2021 | A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.) | |
| pCSFLW reporter plasmid | Di Genova et al., 2021 | A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.) | |
| Penicillin/streptomycin | AUROGENE | AU-L0022-100 | |
| Polyethylenimine, branched (PEI) (25 kDa) | SIGMA-ALDRICH | 408727 | |
| RRL.sin.cPPT.SFFV/Ace2.IRES-puro.WPRE (MT126) | Addgene | 145839 | This plasmid was used to generate HEK293Tcells/ACE2 |
| SARS-CoV-2 Spike expressing plasmid | Addgene | pGBW-m4137382 | |
| steadylite plus Reporter Gene Assay System | Perkin Elmer | 6066759 | In the manuscript, we replaced the commercial name with 'luciferase reading reagent' |
| Trypsin EDTA 1x | AUROGENE | AU-L0949-100 |
Referencias
- Ozaki, D. A., et al. International technology transfer of a GCLP-compliant HIV-1 neutralizing antibody assay for human clinical trials. Plos One. 7 (1), e30963 (2012).
- Pouget, M., et al. Generation of liposomes to study the effect of Mycobacterium tuberculosis lipids on HIV-1 cis- and trans-infections. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1945 (2021).
- McKay, L. G. A., et al. The HCV envelope glycoprotein down-modulates NF-κB signalling and associates with stimulation of the host endoplasmic reticulum stress pathway. Frontiers in Immunology. 13, 831695 (2022).
- Xiang, Q., Li, L., Wu, J., Tian, M., Fu, Y. Application of pseudovirus system in the development of vaccine, antiviral-drugs, and neutralizing antibodies. Microbiological Research. 258, 126993 (2022).
- Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses. Reviews in Medical Virology. 28, e1963 (2018).
- D’Apice, L., et al. Comparative analysis of the neutralizing activity against SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 strain and variants of concern: Performance evaluation of a pseudovirus-based neutralization assay. Frontiers in Immunology. 13, 981693 (2022).
- Falzarano, D., Groseth, A., Hoenen, T. Development and application of reporter-expressing mononegaviruses: current challenges and perspectives. Antiviral Research. 103, 78-87 (2014).
- Gutierrez-Guerrero, A., Cosset, F. -. L., Verhoeyen, E. Lentiviral vector pseudotypes: Precious tools to improve gene modification of hematopoietic cells for research and gene therapy. Viruses. 12, 1016 (2020).
- Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).
- Dull, T. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. Journal of Virology. 72 (11), 8463-8471 (1998).
- Berkhout, B. A Fourth generation lentiviral Vector: Simplifying genomic gymnastics. Molecular Therapy. 25 (8), 1741-1743 (2017).
- Wu, X. Development and evaluation of a pseudovirus-luciferase assay for rapid and quantitative detection of neutralizing antibodies against Enterovirus 71. Plos One. 8 (6), e64116 (2013).
- Ferrara, F., et al. Development of lentiviral vectors pseudotyped with Influenza B hemagglutinins: application in vaccine immunogenicity, mAb potency, and sero-surveillance studies. Frontiers in Immunology. 12, 661379 (2021).
- Hu, J., et al. Development of cell-based pseudovirus entry assay to identify potential viral entry inhibitors and neutralizing antibodies against SARS-CoV-2. Genes & Diseases. 7 (4), 551-557 (2020).
- Dalle Carbonare, L., et al. Serology study after BTN162b2 vaccination in participants previously infected with SARS-CoV-2 in two different waves versus naïve. Communications Medicine. 1 (1), 38 (2021).
- Di Genova, C., et al. Production, titration, neutralisation, storage and lyophilisation of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) lentiviral pseudotypes. Bio-protocol. 11 (21), e4236 (2021).
- Chmielewska, A. M., Czarnota, A., Bieńkowska-Szewczyk, K., Grzyb, K. Immune response against SARS-CoV-2 variants: The role of neutralization assays. NPJ Vaccines. 6 (1), 1-8 (2021).
- Chen, Q., et al. Development and optimization of a sensitive pseudovirus-based assay for HIV-1 neutralizing antibodies detection using A3R5 cells. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (1), 199-208 (2018).
- Gauger, P. C., Vincent, A. L. Serum virus neutralization assay for detection and quantitation of serum neutralizing antibodies to influenza A virus in swine. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 2123, 321-333 (2020).
- Miglietta, R., Pastori, C., Venuti, A., Ochsenbauer, C., Lopalco, L. Synergy in monoclonal antibody neutralization of HIV-1 pseudoviruses and infectious molecular clones. Journal of Translational Medicine. 12 (1), 346 (2014).
- Chen, M., Zhang, X. -. E. Construction and applications of SARS-CoV-2 pseudoviruses: A mini review. International Journal of Biological Sciences. 17 (6), 1574-1580 (2021).
- Zipeto, D., et al. Induction of human immunodeficiency virus neutralizing antibodies using fusion complexes. Microbes and Infection. 8 (6), 1424-1433 (2006).
- WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard. Available from: https://covid19.who.int (2022)
- Zhou, P. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature. 579 (7798), 270-273 (2020).
- Chen, X., Huang, H., Ju, J., Sun, R., Zhang, J. Impact of vaccination on the COVID-19 pandemic in U.S. states. Scientific Reports. 12 (1), 1554 (2022).
- Stefani, C., Fantoni, T., Bissoli, M., Thomas, J., Ruggiero, A. HIV and SARS-CoV-2 Co-Infection: From Population Study Evidence to In Vitro Studies. Life. 12 (12), 2089 (2022).
- Watson, O. J., et al. Global impact of the first year of COVID-19 vaccination: a mathematical modelling study. The Lancet Infectious Diseases. 22 (9), 1293-1302 (2022).
- Cantoni, D. Analysis of antibody neutralisation activity against SARS-CoV-2 variants and seasonal human coronaviruses NL63, HKU1, and 229E induced by three different COVID-19 vaccine olatforms. Vaccines. 11 (1), 58 (2023).
- Siracusano, G., et al. Different decay of antibody response and VOC sensitivity in naïve and previously infected subjects at 15 weeks following vaccination with BNT162b2. Journal of Translational Medicine. 20 (1), 22 (2022).
- Ruggiero, A. SARS-CoV-2 vaccination elicits unconventional IgM specific responses in naïve and previously COVID-19-infected individuals. eBioMedicine. 77, (2022).
- Piubelli, C. Subjects who developed SARS-CoV-2 specific IgM after vaccination show a longer humoral immunity and a lower frequency of infection. eBioMedicine. 89, 104471 (2023).
- Zhang, G. F. Infectivity of pseudotyped SARS-CoV-2 variants of concern in different human cell types and inhibitory effects of recombinant spike protein and entry-related cellular factors. Journal of Medical Virology. 95 (1), e28437 (2023).
- da Costa, K. A. S. Influenza A (N1-N9) and Influenza B (B/Victoria and B/Yamagata) neuraminidase pseudotypes as tools for pandemic preparedness and improved influenza vaccine design. Vaccines. 10 (9), 1520 (2022).
- Condor Capcha, J. M. Generation of SARS-CoV-2 spike pseudotyped virus for viral entry and neutralization assays: a 1-week protocol. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 7, 618651 (2021).
- Diomede, L., et al. Doxycycline inhibition of a pseudotyped virus transduction does not translate to inhibition of SARS-CoV-2 infectivity. Viruses. 13 (9), 1745 (2021).
