Voorbereiding en immunofluorescentiekleuring van bundels en enkelvoudige vezelcellen uit de cortex en de kern van de ooglens

De lens is een helder en eivormig weefsel in de voorste oogkamer dat bestaat uit twee celtypen, epitheel- en vezelcellen 1 (Figuur 1). Er is een monolaag van epitheelcellen die de voorste hemisfeer van de lens bedekt. Vezelcellen worden onderscheiden van epitheelcellen en vormen het grootste deel van de lens. De zeer gespecialiseerde vezelcellen ondergaan een verlenging, differentiatie en rijpingsprogrammering, gekenmerkt door duidelijke veranderingen in de morfologie van het celmembraan van de lensperiferie naar het lenscentrum 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 , ook wel bekend als de lenskern. De functie van de lens om licht dat van verschillende afstanden op het netvlies komt fijn te focussen, hangt af van de biomechanische eigenschappen ervan, waaronder stijfheid en elasticiteit 13,14,15,16,17,18,19. De complexe interdigitaties van lensvezels zijn verondersteld^20,21 en onlangs is aangetoond dat ze belangrijk zijn voor lensstijfheid^22,23.

Figuur 1: Lensanatomiediagrammen en representatieve scanning-elektronenmicroscopie (SEM)-beelden van lensvezels. De cartoon toont een longitudinaal (van voren naar achteren van boven naar beneden) weergave van de voorste monolaag van epitheelcellen (lichtblauw gearceerd) en een bulkmassa lensvezelcellen (wit). Het midden van de lens (roze gearceerd) staat bekend als de kern en bestaat uit sterk verdichte vezelcellen. Aan de rechterkant onthult een cartoon met dwarsdoorsnede de langwerpige zeshoekige celvorm van lensvezels die in een honingraatpatroon zijn verpakt. Vezelcellen hebben twee brede zijden en vier korte zijden. Representatieve SEM-beelden langs de onderkant tonen de complexe membraaninterdigitaties tussen lensvezelcellen op verschillende diepten van de lens. Van rechts hebben nieuw gevormde lensvezels aan de rand van de lens kleine uitsteeksels langs de korte zijden en kogels langs de brede kant (rode vakken). Tijdens de rijping ontwikkelen lensvezels grote peddeldomeinen die worden versierd met kleine uitsteeksels langs de korte zijden (blauwe vakken). Rijpe vezelcellen bezitten grote peddeldomeinen die worden geïllustreerd door kleine uitsteeksels. Deze in elkaar grijpende domeinen zijn belangrijk voor de biomechanische eigenschappen van lenzen. Vezelcellen in de lenskern hebben minder kleine uitsteeksels langs hun korte zijden en hebben complexe tand-en-groef-interdigitaties (paarse vakken). De brede zijden van de cel vertonen een bolvormige membraanmorfologie. De cartoon is aangepast van^22,32 en niet op schaal getekend. Schaalbalk = 3 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De lens groeit door schelpen van nieuwe vezelcellen toe te voegen die bovenop eerdere generaties vezels zijn gelegd^24,25. Vezelcellen hebben een langwerpige, zeshoekige dwarsdoorsnedevorm met twee brede zijden en vier korte zijden. Deze cellen strekken zich uit van de voorste tot de achterste pool van de lens en afhankelijk van de soort kunnen de lensvezels enkele millimeters lang zijn. Om de structuur van deze langwerpige en dunne cellen te ondersteunen, creëren gespecialiseerde interdigitaties langs de brede en korte zijden in elkaar grijpende structuren om de vorm van de lens en de biomechanische eigenschappen te behouden. Veranderingen in de vorm van het celmembraan tijdens de differentiatie en rijping van vezelcellen zijn uitgebreid gedocumenteerd door elektronenmicroscopie (EM) studies 2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,26,27,28,29 . Nieuw gevormde vezelcellen hebben ballen-en-sockets langs hun brede zijden met zeer kleine uitsteeksels langs hun korte zijden, terwijl volwassen vezels in elkaar grijpende uitsteeksels en peddels langs hun korte zijden hebben. Kernvezels vertonen tand-en-groef-interdigitaties en bolvormige membraanmorfologie. Er is weinig bekend over de eiwitten die nodig zijn voor deze complexe in elkaar grijpende membranen. Eerdere studies naar eiwitlokalisatie in vezelcellen waren gebaseerd op lensweefselsecties, die geen duidelijke visualisatie van de complexe celarchitectuur mogelijk maken.

Dit werk heeft een nieuwe methode gecreëerd en geperfectioneerd om enkele en bundels lensvezelcellen te fixeren om de complexe morfologie te behouden en om immunokleuring voor eiwitten op het celmembraan en in het cytoplasma mogelijk te maken. Deze methode behoudt getrouw de celmembraanarchitectuur, vergelijkbaar met gegevens uit EM-studies, en maakt kleuring mogelijk met primaire antilichamen voor specifieke eiwitten. We hebben eerder immunogekleurde corticale lensvezels die differentiatie en rijping ondergaan^22,23. In dit protocol is er ook een nieuwe methode om vezelcellen uit de lenskern te kleuren. Dit protocol opent de deur naar het begrijpen van de mechanismen voor vorming en veranderingen in membraaninterdigitaties tijdens de rijping van vezelcellen en de verdichting van de lenskern.