הכנה וצביעה אימונופלואורסצנטית של צרורות ותאי סיבים בודדים מקליפת המוח וגרעין עדשת העין

העדשה היא רקמה שקופה וביצית בחדר הקדמי של העין שמורכבת משני סוגי תאים, תאי אפיתל ותאי סיבים 1 (איור 1). יש monolayer של תאי אפיתל המכסה את ההמיספרה הקדמית של העדשה. תאי סיבים נבדלים מתאי אפיתל ומהווים את עיקר העדשה. תאי הסיבים המתמחים עוברים תהליך התארכות, התמיינות והבשלה, המתבטא בשינויים ברורים במורפולוגיית קרום התא מפריפריית העדשה למרכז העדשה 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ידוע גם בשם גרעין העדשה., תפקידה של העדשה למקד אור עדין המגיע ממרחקים שונים אל הרשתית תלוי בתכונותיה הביומכניות, כולל קשיחות ואלסטיות 13,14,15,16,17,18,19. האינטרדיגיטציות המורכבות של סיבי העדשה הועלו^20,21 ולאחרונה הוכחו כחשובות לנוקשות העדשה^22,23.

איור 1: דיאגרמות אנטומיה של עדשה ותמונות של מיקרוסקופ אלקטרונים סורק מייצג (SEM) מסיבי עדשה. הקריקטורה מראה מבט אורכי (קדמי עד אחורי מלמעלה למטה) של השכבה הקדמית של תאי אפיתל (מוצללת בתכלת) ומסה גדולה של תאי סיבי עדשה (לבן). מרכז העדשה (מוצלל בוורוד) ידוע כגרעין והוא מורכב מתאי סיבים דחוסים מאוד. מימין, קריקטורה בחתך רוחב חושפת את צורת תא המשושה המוארך של סיבי עדשה הארוזים בתבנית חלת דבש. לתאי סיבים יש שני צדדים רחבים וארבעה צדדים קצרים. תמונות SEM מייצגות לאורך החלק התחתון מראות את האינטרדיגיטציות המורכבות של הממברנה בין תאי סיבי העדשה בעומקים שונים של העדשה. מימין, סיבי עדשה חדשים שנוצרו בשולי העדשה הם בעלי בליטות קטנות לאורך הצדדים הקצרים וכדורים ושקעים לאורך הצד הרחב (קופסאות אדומות). במהלך ההתבגרות, סיבי העדשה מפתחים אזורי משוטים גדולים המעוטרים על ידי בליטות קטנות לאורך הצדדים הקצרים (קופסאות כחולות). תאי סיבים בוגרים הם בעלי תחומי משוט גדולים המודגמים על ידי בליטות קטנות. תחומים שלובים אלה חשובים לתכונות ביומכניות של העדשה. לתאי סיבים בגרעין העדשה יש פחות בליטות קטנות לאורך הצדדים הקצרים שלהם ויש להם אינטרדיגיטציות מורכבות של לשון וחריץ (קופסאות סגולות). הצדדים הרחבים של התא מציגים מורפולוגיה של קרום כדורי. הקריקטורה שונתה^מ-22,32 ולא צוירה בקנה מידה. סרגל קנה מידה = 3 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

העדשה גדלה על ידי הוספת קליפות של תאי סיבים חדשים על גבי הדורות הקודמים של סיבים^24,25. לתאי סיבים יש צורת חתך משושה מוארכת עם שתי צלעות רחבות וארבע צלעות קצרות. תאים אלה משתרעים מהקוטב הקדמי לקוטב האחורי של העדשה, ובהתאם למין, סיבי העדשה יכולים להיות באורך של כמה מילימטרים. כדי לתמוך במבנה של תאים מוארכים ורזים אלה, אינטרדיגיטציות מיוחדות לאורך הצדדים הרחבים והקצרים יוצרות מבנים שלובים כדי לשמור על צורת העדשה ועל התכונות הביומכניות. שינויים בצורת קרום התא במהלך התמיינות ובגרות תאי סיבים תועדו בהרחבה על ידי מחקרי מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) 2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,26,27,28,29 . לתאי סיבים שזה עתה נוצרו יש כדורים ושקעים לאורך הצדדים הרחבים שלהם עם בליטות קטנות מאוד לאורך הצדדים הקצרים שלהם, בעוד שלסיבים בוגרים יש בליטות משתלבות ומשוטים לאורך הצדדים הקצרים שלהם. סיבים גרעיניים מציגים אינטרדיגיטציות של לשון וחריץ ומורפולוגיה של קרום כדורי. מעט ידוע על החלבונים הדרושים לממברנות שלובות מורכבות אלה. מחקרים קודמים על לוקליזציה של חלבונים בתאי סיבים הסתמכו על מקטעי רקמת העדשה, שאינם מאפשרים הדמיה ברורה של ארכיטקטורת התא המורכבת.

עבודה זו יצרה ושכללה שיטה חדשנית לקיבוע בודדים וצרורות של תאי סיבי עדשה כדי לשמר את המורפולוגיה המורכבת ולאפשר צביעה חיסונית של חלבונים בקרום התא ובתוך הציטופלסמה. שיטה זו משמרת נאמנה את ארכיטקטורת קרום התא, הדומה לנתונים ממחקרי EM, ומאפשרת צביעה בנוגדנים ראשוניים לחלבונים ספציפיים. בעבר יש לנו סיבי עדשה קורטיקלית חיסונית שעוברים התמיינות והתבגרות^22,23. בפרוטוקול זה קיימת גם שיטה חדשה להכתמת תאי סיבים מגרעין העדשה. פרוטוקול זה פותח את הדלת להבנת מנגנוני היווצרות ושינויים באינטרדיגיטציות של ממברנות במהלך הבשלת תאי סיבים ודחיסת גרעין העדשה.