Este protocolo descreve em detalhes como construir um microscópio de fluorescência de lâmina de luz de objetiva única e seu uso para visualizar redes de citoesqueleto.
Compósitos reconstituídos do citoesqueleto têm emergido como um valioso sistema modelo para o estudo da matéria mole fora do equilíbrio. A captura fiel da dinâmica dessas redes densas e 3D exige seccionamento óptico, que é frequentemente associado a microscópios confocais de fluorescência. No entanto, desenvolvimentos recentes na microscopia de fluorescência de folhas de luz (LSFM) estabeleceram-na como uma alternativa econômica e, às vezes, superior. Para tornar o LSFM acessível aos pesquisadores do citoesqueleto menos familiarizados com a óptica, apresentamos um guia passo a passo para iniciantes para a construção de um microscópio de fluorescência versátil de folhas de luz a partir de componentes prontos para uso. Para permitir a montagem de amostras com amostras de lâminas tradicionais, este LSFM segue o design de folha de luz de objetivo único (SOLS), que utiliza uma única objetiva para a coleta de excitação e emissão. Descrevemos a função de cada componente do SOLS em detalhes suficientes para permitir que os leitores modifiquem a instrumentação e a projetem para atender às suas necessidades específicas. Finalmente, demonstramos o uso deste instrumento SOLS personalizado visualizando asters em redes de microtúbulos acionadas por cinesina.
A microscopia de fluorescência de folha de luz (LSFM) representa uma família de técnicas de imagem de fluorescência de alta resolução em que a luz de excitação é moldada em uma folha 1,2, incluindo microscopia de iluminação plana seletiva (SPIM), excitação planar confocamente alinhada varrida (SCAPE) e microscopia de plano oblíquo (OPM)3,4,5,6,7. Ao contrário de outras modalidades de microscopia, como epifluorescência, microscopia de fluorescência por reflexão interna total (TIRFM) ou microscopia confocal, a fototoxicidade é mínima no LSFM e as amostras podem ser imageadas em escalas de tempo mais longas, pois apenas o plano da amostra que está sendo ativamente fotografada é iluminado 8,9,10. Portanto, as técnicas de LSFM são extremamente úteis para a obtenção de imagens de amostras 3D em longos períodos de tempo, notadamente mesmo aquelas muito espessas para técnicas de microscopia confocal. Por essas razões, desde seu desenvolvimento original em 2004, o LSFM tornou-se a técnica de imagem de escolha para muitos fisiologistas, biólogos do desenvolvimento e neurocientistas para a visualização de organismos inteiros, como zebrafish vivo e embriões de Drosophila 3,4,6,11 . Nessas duas últimas décadas, as vantagens do LSFM têm sido aproveitadas para visualizar estrutura e dinâmica em escalas progressivamente menores, incluindo as escalastecidual11,12, celular e subcelular, tanto in vivo quanto in vitro13,14,15,17.
Apesar dos relatos de casos de uso bem-sucedidos na literatura, o alto custo dos sistemas comerciais de LSFM (~0,25 milhões de dólares até o momento em que este artigo foi escrito)18,19 impede o uso generalizado da técnica. Para tornar o DIY uma alternativa viável para pesquisadores, vários guias de construção foram publicados 8,13,20,21, incluindo o esforço de acesso aberto OpenSPIM 22. No entanto, até o momento, pesquisadores com experiência óptica mínima só podem usar desenhos LSFM anteriores, que são incompatíveis com amostras tradicionais montadas em lâminas (Figura 1A). A recente implementação de um único objetivo, light-sheet (SOLS) utiliza um único objetivo tanto para a excitação quanto para a detecção (Figura 1C), superando assim a limitação relacionada à compatibilidade 5,6,8,13,20. No entanto, o custo para a versatilidade do projeto SOLS é um aumento substancial na complexidade da construção devido à exigência de duas objetivas adicionais para retransmitir, desinclinar e recriar imagens do plano do objeto na câmera para geração de imagens (Figura 1D). Para facilitar o acesso às configurações complexas no estilo SOLS, este artigo apresenta um guia passo a passo sobre o projeto, construção, processo de alinhamento e uso de um sistema SOLS compatível com slides, que seria útil para pesquisadores com conhecimento de apenas um curso de óptica de nível básico.
Embora o protocolo em si seja sucinto, os leitores devem consultar outros recursos durante as etapas de preparação para saber mais sobre partes específicas do design ou considerações de hardware. No entanto, se um leitor pretende seguir as especificações deste projeto, pode não ser necessário entender como selecionar componentes ópticos específicos.
Figura 1: Características das diferentes configurações do LSFM. (A) A configuração com dois objetivos ortogonais comuns nos primeiros projetos de LSFM. Nesta configuração, um tubo capilar ou um cilindro de gel é usado para conter a amostra, o que não é compatível com as técnicas tradicionais de montagem por lâmina. (B) Um esquema de um desenho de folha luminosa SOLS mostrando o seguinte: (C) o objetivo único usado tanto para a excitação quanto para a coleta de emissões no plano da amostra (O1); isso permite que uma corrediça tradicional seja montada na parte superior, e (D) o sistema de objetiva do relé no caminho de emissão SOLS. O O2 coleta a luz de emissão e desamplia a imagem. O O3 fotografa o plano no ângulo de inclinação correto no sensor da câmera. Abreviações: LSFM = microscopia de fluorescência de folhas; SOLS = folha luminosa de objetivo único; O1-O3 = objetivos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Dois detalhes importantes sobre esse protocolo são o custo geral do sistema e o tempo esperado de construção e alinhamento. Embora o custo exato seja variável, podemos confortavelmente estimar que o custo in toto deste SOLS ou de um sistema DIY semelhante cairia na faixa de US$ 85.000. Observamos que esta estimativa considera o preço de varejo de todos os componentes, portanto, esse preço global pode ser bastante reduzido pelo fornecimento de componentes usados. Em termos de tempo de construção, seria razoável esperar que um usuário com pouca experiência óptica construísse e alinhasse todo esse sistema SOLS dentro de 1-2 meses, desde que todos os componentes estejam disponíveis e prontos. Apesar da extensão e complexidade do protocolo, acreditamos que a quantidade de detalhes no manuscrito escrito, pareado com o protocolo de vídeo, deve tornar este protocolo simples e rápido de seguir.
Há duas etapas críticas neste protocolo. Primeiro, a colocação do galvo determina o posicionamento de muitas lentes, pois faz parte de três pares de lentes 4f separados. É crucial que o galvo seja conjugado com os planos focais traseiros de O1 e O2 e centralizado corretamente para garantir a varredura invariante de inclinação. Em segundo lugar, a qualidade da imagem é extremamente sensível ao alinhamento de O2 e O3 em relação um ao outro. Aqui, deve-se tomar cuidado para garantir que, primeiro, o ângulo de alinhamento de O3 a O2 corresponda à inclinação da folha de luz de excitação, fornecendo assim iluminação plana máxima em todo o FoV igualmente inclinado. Em segundo lugar, o O3 deve ser colocado na distância axial correta para manter um FoV plano com a maior área possível. Terceiro, o O3 deve ser colocado na distância lateral correta do O2 para maximizar o sinal que passa pela interface O2-O3.
Em termos de FoV utilizável, este sistema alcançou um campo plano e confiável com iluminação consistente em uma área de 80 μm x 80 μm. Essa área é menor do que o FoV máximo fornecido pela câmera, de modo que o FoV utilizável é indicado pela caixa amarela na Figura 13. Em termos de poder de resolução, esse sistema alcançou uma distância mínima resolúvel de 432 nm ao longo do eixo x e 421 nm ao longo do eixo y, que foi medida encontrando o sigma x e y médios das funções gaussianas de dispersão pontual (PSFs) no bom FoV e multiplicando por dois. Observamos que este sistema não foi otimizado em termos de seu NA total, o que significa que há espaço para melhorias significativas se os usuários desejarem um poder de resolução maior do que o que este sistema alcançou. Há uma infinidade de opções objetivas compatíveis para esse tipo de construção SOLS, muitas das quais contribuiriam para uma maior resolução do sistema, mas com as desvantagens de um custo mais alto, um FoV menor ou técnicas de alinhamento mais complicadas na interface do relé 8,11,13,20. Separadamente, se os usuários desejarem um FoV maior, a incorporação de um segundo galvo para permitir a digitalização 2D atingiria esse objetivo, mas exigiria óptica e mecânica de controle adicionais para serem integradas ao projeto32. Fornecemos mais detalhes sobre as modificações no sistema em nossa página do site, juntamente com links para outros recursos úteis sobre o processo de design23.
Além de melhorar os componentes específicos para este projeto em particular, seria muito viável adicionar outras técnicas ou modalidades de microscopia de alta resolução a esta construção. Uma dessas melhorias seria incorporar a iluminação multicomprimento de onda, o que envolveria o alinhamento de lasers de excitação adicionais ao caminho de excitação original8. Além disso, como esse tipo de desenho do SOLS deixa a amostra acessível, a adição de funções adicionais ao microscópio, incluindo, mas limitadamente, tweezing óptico, microfluídica e reometria, é relativamente simples 2,33.
Em comparação com a miríade de guias de folha de luz que foram publicados, este protocolo fornece instruções em um nível de compreensão que um usuário sem experiência óptica significativa pode achar útil. Ao tornar uma construção SOLS fácil de usar com recursos tradicionais de montagem de lâminas de amostra acessível a um público maior, esperamos permitir uma expansão ainda maior das aplicações da pesquisa baseada em SOLS em todos os campos em que o instrumento tem ou poderia ser utilizado. Mesmo com as aplicações dos instrumentos SOLS crescendo rapidamente em número 2,34,35, acreditamos que muitos benefícios e utilizações de instrumentos do tipo SOLS ainda permanecem inexplorados e expressam entusiasmo com as possibilidades desse tipo de instrumento avançar.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pelo National Science Foundation (NSF) RUI Award (DMR-2203791) para J.S. Somos gratos pela orientação fornecida pelo Dr. Bin Yang e pelo Dr. Manish Kumar durante o processo de alinhamento. Agradecemos à Dra. Jenny Ross e K. Alice Lindsay pelas instruções de preparação para os motores de cinesina.
1" Plano-Concave Lens f = -50 mm | Thorlabs | LC1715-A-ML | For alignment laser Estimated Cost: $49.5 |
1" Achromatic Doublet f = 100 mm (x3) | Thorlabs | AC254-100-A-ML | L2, L4 and alignment laser Estimated Cost: $342.42 |
1" Achromatic Doublet f = 125 mm | Thorlabs | AC254-125-A-ML | SL2 Estimated Cost: $114.14 |
1" Achromatic Doublet f = 150 mm | Thorlabs | AC254-150-A-ML | L3 Estimated Cost: $114.14 |
1" Achromatic Doublet f = 150 mm | Thorlabs | AC254-150-A-ML | TL2 Estimated Cost: $114.14 |
1" Achromatic Doublet f = 45 mm | Thorlabs | AC254-045-A-ML | L1 Estimated Cost: $114.14 |
1" Achromatic Doublet f = 75 mm | Thorlabs | AC254-075-A-ML | SL1 Estimated Cost: $114.14 |
1" Cylindrical Lens f = 100 mm | Thorlabs | LJ1567RM | CL3 Estimated Cost: $117.62 |
1" Cylindrical Lens f = 200 mm | Thorlabs | LJ1653RM | CL2 Estimated Cost: $111.22 |
1" Cylindrical Lens f = 50 mm | Thorlabs | LJ1695RM | CL1 Estimated Cost: $117.62 |
1" Mounted Pinhole, 30 µm Pinhole Diameter | Thorlabs | P30K | Estimated Cost: $77.08 |
1" Silver Mirror (x3) | Thorlabs | PF10-03-P01 | M1, M2, one for alignment Estimated Cost: $168.78 |
2" Elliptical Mirror | Thorlabs | PFE20-P01 | M3 Estimated Cost: $179.98 |
2" Post Holder (x11) | Thorlabs | PH2 | For custom laser mount, ND wheel, safety screens Estimated Cost: $98.45 |
2" Posts (x47) | Thorlabs | TR2 | For custom laser mount and optical components Estimated Cost: $277.3 |
3" Posts (x4) | Thorlabs | TR3 | For M3 supports and other mounts Estimated Cost: $24.6 |
3" Post Holder (x4) | Thorlabs | PH3 | Estimated Cost: $38.48 |
30 to 60 mm Cage Adapter | Thorlabs | LCP33 | To mount O1 Estimated Cost: $45.42 |
30mm Cage Filter Wheel | Thorlabs | CFW6 | To mount ND filters Estimated Cost: $172.36 |
30mm Cage Plate (x6) | Thorlabs | CP33 | To build alignment cage and alignment laser Estimated Cost: $114.54 |
30mm Right-Angle Kinematic Mirror Mount (x3) | Thorlabs | KCB1 | To mount M1 and M2 and for alignment laser Estimated Cost: $463.95 |
4" Post Holder (x30) | Thorlabs | PH4 | Estimated Cost: $320.1 |
561 nm Laser and Power Supply | Opto Engine LLC | MGL-FN-561-100mW | Excitation laser Estimated Cost: $6000 |
60mm Cage Plate (x2) | Thorlabs | LCP01 | To mount TL1 and M3 mount Estimated Cost: $88.52 |
60mm Right-Angle Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | KCB2 | To mount M3 Estimated Cost: $187.26 |
90° Flip Mount | Thorlabs | TRF90 | For alignment laser Estimated Cost: $95.5 |
Adapter with External C-Mount Threads and Internal SM1 Threads | Thorlabs | SM1A9 | To connect lens tube to camera Estimated Cost: $20.96 |
Adapter with External SM1 Threads and Internal C-Mount Threads | Thorlabs | SM1A10 | To connect tube lens to lens mount Estimated Cost: $21.82 |
Adapter with External SM1 Threads and Internal M25 Threads (x2) | Thorlabs | SM1A12 | To mount O1 and O2 Estimated Cost: $47.06 |
Adapter with External SM1 Threads and Internal M26 Threads | Thorlabs | SM1A27 | To mount O3 Estimated Cost: $22.38 |
Alignment Disk | Thorlabs | SM1A7 | Estimated Cost: $20.45 |
Alignment Laser | BISKEE | https://www.amazon.com/Tactical-Presentation-Teaching-Interactive-Adjustable/dp/B09B1VXPNM Estimated Cost: $16.98 |
|
Autoluorescent Plastic Slide, Red | Chroma | 92001 | Estimated Cost: $20 |
Beam Shutter | Thorlabs | SM1SH1 | To block laser light Estimated Cost: $65.8 |
Cage Rotation Mount (x3) | Thorlabs | CRM1T | To mount CL1-3 Estimated Cost: $282.15 |
Cage System Rods 1" (x8) | Thorlabs | ER1 | To mount M3 and O1 Estimated Cost: $44.8 |
Cage System Rods 3" (x2) | Thorlabs | ER3 | To mount O3 Estimated Cost: $14.28 |
Cage System Rods 4" (x4) | Thorlabs | ER4 | To mount slit Estimated Cost: $30.76 |
Cage System Rods 8" (x2) | Thorlabs | ER8 | For tube lens alignment Estimated Cost: $25.3 |
Cage System Rods 12" (x8) | Thorlabs | ER12 | For alignment cage Estimated Cost: $145.36 |
Camera | Andor | Zyla 4.2 sCMOS | Estimated Cost: ~$14,000 |
Clamping Fork (x35) | Thorlabs | CF125 | To clamp down post mounts Estimated Cost: $338.8 |
Cover Glass, 22 x 22 mm | Corning | 2850-22 | For slide samples Estimated Cost: $265 |
Dichroic | AVR | DI01-R405/488/561/635-25×36 | To split exciation/emission paths Estimated Cost: $965 |
Dovetail Translation Stage | Thorlabs | DT12 | To translate pinhole Estimated Cost: $90.55 |
Emission Filter | Thorlabs | FELHO600 | Estimated Cost: $140.99 |
Frosted Glass Alignment Disk (x2) | Thorlabs | DG10-1500-H1 | For alignment cage and intermediate plane Estimated Cost: $75.14 |
Function Generator | Hewlett-Packard | HP 33120A 15 MHz | To control galvo Estimated Cost: $900 |
Galvanometer – 1D Large Beam Diameter System | Thorlabs | GVS011 | Estimated Cost: $1715.78 |
Galvanometer Power Supply | Siglent | SPD3303C | Estimated Cost: $300 |
Gelrite | Research Products International | G35020-100.0 | Gellan gum for 3D bead sample Estimated Cost: $68.25 |
FIJI Software | Open-source | Download from https://imagej.net/software/fiji/downloads Estimated Cost: Free |
|
Hot Plate/ Stirrer | Corning | 6795-220 | For preparing sample solutions Estimated Cost: $550 |
K-Cube Brushed Motor Controller | Thorlabs | KDC101 | Drives Z825B Estimated Cost: $757.51 |
Kinematic Mount | Thorlabs | KM100S | To mount dichroic Estimated Cost: $92.01 |
Kinesis Software | Thorlabs | Download from https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=10285 Estimated Cost: Free |
|
Laser Light Blocker | Thorlabs | LB1 | For ND filter reflections Estimated Cost: $57.65 |
Laser Mount | custom made | 3D printed Estimated Cost: N/A |
|
Laser Safety Screen (x2) | Thorlabs | TPS4 | For blocking stray laser light Estimated Cost: $92.02 |
Laser Scanning Tube Lens | Thorlabs | TTL200MP | TL1 Estimated Cost: $1491 |
Lens Mount (x10) | Thorlabs | LMR1 | To mount all lens and extra alignment mirror. Estimated Cost: $164.7 |
Magnetic Ruler | Thorlabs | BHM4 | To check alignment Estimated Cost: $52.74 |
Micro-Manager Software | Open-source | Download from https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release Estimated Cost: Free |
|
Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 12550400 | For slide samples Estimated Cost: $123.9 |
Microscope Stage | ASI | FTP-2000 with custom parts | To fine-translate samples Estimated Cost: ~$16,000 |
Mini Vortex Mixer | VWR | 10153-688 | For sample preparation Estimated Cost: $152.64 |
Motorized Actuator | Thorlabs | Z825B | To fine-translate M1 Estimated Cost: $729.07 |
Mounted Standard Iris (x2) | Thorlabs | ID20 | At least 2 for alignment Estimated Cost: $118.02 |
ND Filter Set | Thorlabs | NDK01 | To reduce excitation intensity Estimated Cost: $726.73 |
Objective Lens 1 | Nikon | Plan Apo 60X/ 1.20 WI | O1 Estimated Cost: ~$15,000 |
Objective Lens 2 | Nikon | TU Plan Fluor 100X/0.90 | O2 Estimated Cost: ~$6,000 |
Objective Lens 3 | Mitutoyo | Plan Apo HR 50X/0.75 | O3 Estimated Cost: ~$6,800 |
OPM Deskewing Software | Open-source | For image processing. Download from https://github.com/QI2lab/OPM Estimated Cost: Free |
|
Photodiode Power Sensor | Thorlabs | S121C | For measuring laser intensity Estimated Cost: $379.68 |
Positive Grid Distortion Target | Thorlabs | R1L3S3P | Brightfield alignment Estimated Cost: $267.87 |
Power Meter Digital Console | Thorlabs | PM100D | For measuring laser intensity Estimated Cost: $1245.48 |
Rhodamine 6G | Thermo Scientific | J62315.14 | For fluorescent coated slide sample Estimated Cost: $27.7 |
Right-Angle Clamp for Posts | Thorlabs | RA90 | For M3 support and flip down mirror Estimated Cost: $32.46 |
RMS-Threaded Cage Plate (x2) | Thorlabs | CP42 | For alignment laser Estimated Cost: $70.56 |
Shear Plate 2.5-5.0 mm | Thorlabs | SI050P | Estimated Cost: $182.85 |
Shear Plate 5.0-10.0 mm | Thorlabs | SI100P | Estimated Cost: $201.47 |
Shear Plate 10.0-25.4 mm | Thorlabs | SI254P | Estimated Cost: $236.42 |
Shear Plate Viewing Screen | Thorlabs | SIVS | Estimated Cost: $337.74 |
Shearing Interferometer with 1-3 mm Plate | Thorlabs | SI035 | For checking collimation Estimated Cost: $465.85 |
Slip-On Post Collar (x35) | Thorlabs | R2 | To maintain post height Estimated Cost: $208.25 |
Slit | Thorlabs | VA100 | Estimated Cost: $294.64 |
Slotted Lens Tube, 3" | Thorlabs | SM1L30C | For alignment laser Estimated Cost: $77.45 |
Square Mirror, 1 x 1" | https://www.amazon.com/Small-Square-Mirror-Pieces-Mosaic/dp/B07FBNMDC1/ref=asc_df_B07FBNMDC1/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hva did=642191768069&hvpos=&hvne tw=g&hvrand=1336734911900437 4691&hvpone=&hvptwo=&hvqmt= &hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint=& hvlocphy=9031212&hvtargid=pla-1 943952718742&gclid=Cj0KCQiA6L yfBhC3ARIsAG4gkF_AYBpn5EdGL q3mc-RU-nanT5vM4ac9r3-obbzqJoWKPkIPIJU6e1caAjWmEA Lw_wcB&th=1 Estimated Cost: $14.76 |
||
Stackable Lens Tube 1/2" (x3) | Thorlabs | SM1L05 | To mount CL1-3 Estimated Cost: $40.86 |
Stackable Lens Tube 1" | Thorlabs | SM1L10 | To mount O3 Estimated Cost: $15.41 |
Stackable Lens Tube 2" (x2) | Thorlabs | SM1L20 | For camera path Estimated Cost: $35.7 |
Studded Pedestal Base Adapter (x37) | Thorlabs | BE1 | To attach post mounts to table Estimated Cost: $400.71 |
Translating Lens Mount (x3) | Thorlabs | LM1XY | To fine-translate pinhole, O2 and O3 Estimated Cost: $441 |
Translation Stage with Standard Micrometer (x2) | Thorlabs | PT1/M | TS1-2 Estimated Cost: $647.54 |
Travel Manual Translation Stage | Thorlabs | CT1A | O3 cage translation mount Estimated Cost: $497.3 |
Tube Lens | Nikon | MXA20696 | TL3 Estimated Cost: $359 |
White Mounted LED | Thorlabs | MNWHL4 | Brightfield light source Estimated Cost: $171.28 |
TOTAL ESTIMATED COST: $84,858.98 | |||
The authors note that many parts were bought used. Here, we have attempted to reflect the retail price of all items, so the total cost can be greatly reduced by buying particular items used, especially the more expensive ones. | |||
OPTIONAL COMPONENTS | |||
Grasshopper3 USB3 | FLIR | GS3-U3-23S6C-C | For diagnostic checks during alignment. Acquisiton camera can be used instead, but requires realignment afterwards. Estimated Cost: $1089 |