Summary

Ein modifiziertes transkranielles Modell für den Verschluss der mittleren Hirnarterie zur Untersuchung von Schlaganfallergebnissen bei gealterten Mäusen

Published: May 05, 2023
doi:

Summary

Dieses Protokoll demonstriert ein einzigartiges Mausschlagmodell mit einem mittelgroßen Infarkt und einer ausgezeichneten Überlebensrate. Dieses Modell ermöglicht es präklinischen Schlaganfallforschern, die Dauer der Ischämie zu verlängern, gealterte Mäuse zu verwenden und langfristige funktionelle Ergebnisse zu bewerten.

Abstract

In der experimentellen Schlaganfallforschung wird der Verschluss der mittleren Hirnarterie (MCAO) mit einem intraluminalen Filament häufig verwendet, um einen ischämischen Schlaganfall bei Mäusen zu modellieren. Das Filament-MCAO-Modell zeigt typischerweise einen massiven Hirninfarkt bei C57Bl/6-Mäusen, der manchmal Hirngewebe in dem Gebiet umfasst, das von der hinteren Hirnarterie versorgt wird, was weitgehend auf eine hohe Inzidenz von posteriore kommunizierenden Arterienatresie zurückzuführen ist. Dieses Phänomen wird als ein wesentlicher Faktor für die hohe Mortalitätsrate angesehen, die bei C57Bl/6-Mäusen während der langfristigen Schlaganfallerholung nach Filament-MCAO beobachtet wurde. Daher nutzen viele Studien zu chronischen Schlaganfällen distale MCAO-Modelle. Diese Modelle erzeugen jedoch in der Regel nur einen Infarkt im Bereich der Großhirnrinde, so dass die Beurteilung neurologischer Defizite nach einem Schlaganfall eine Herausforderung darstellen könnte. In dieser Studie wurde ein modifiziertes transkranielles MCAO-Modell etabliert, bei dem das MCA am Rumpf entweder dauerhaft oder vorübergehend über ein kleines Schädelfenster teilweise verschlossen ist. Da die Okklusionsstelle relativ nahe am Ursprung des MCA liegt, erzeugt dieses Modell Hirnschäden sowohl im Kortex als auch im Striatum. Eine umfangreiche Charakterisierung dieses Modells hat eine hervorragende Langzeitüberlebensrate, auch bei gealterten Mäusen, sowie leicht nachweisbare neurologische Defizite gezeigt. Daher stellt das hier beschriebene MCAO-Mausmodell ein wertvolles Werkzeug für die experimentelle Schlaganfallforschung dar.

Introduction

Fast 800.000 Menschen erleiden in den USA jedes Jahr einen Schlaganfall, und die meisten dieser Schlaganfälle sind ischämischer Natur1. Die rechtzeitige Wiederherstellung des zerebralen Blutflusses mit einem Gewebeplasminogenaktivator (tPA) und/oder einer Thrombektomie ist derzeit die wirksamste Behandlung für Schlaganfallpatienten. Die vollständige Wiederherstellung neurologischer Funktionen auf lange Sicht ist jedoch selten 2,3. Daher ist die Suche nach neuartigen Schlaganfalltherapien, die auf eine funktionelle Verbesserung abzielen, ein intensives Forschungsgebiet, das klinisch relevante Tiermodelle für Schlaganfälle erfordert.

Das häufigste ischämische Schlaganfallmodell bei Nagetieren verwendet den intraluminalen Verschluss der mittleren Hirnarterie (MCAO), um einen Schlaganfall zu induzieren. Bei diesem Modell, das ursprünglich 1989 von Zea Longa entwickelt wurde, wird ein Nylonfilament in die Arteria carotis interna (ICA) eingeführt, um den Blutfluss zur mittleren Hirnarterie (MCA) zu blockieren4. Dieses Modell hat jedoch seine Grenzen. Erstens, wenn das Filament in das ICA eingeführt wird, könnte auch der Blutfluss zur hinteren Hirnarterie (PCA) teilweise blockiert werden, insbesondere bei Mäusen. Kritisch ist, dass die hintere kommunizierende Arterie (PcomA), eine kleine Arterie, die den vorderen und hinteren Hirnkreislauf verbindet, bei einigen Mausstämmen häufig unterentwickelt ist, wie z. B. C57Bl/6, dem Stamm, der hauptsächlich in der experimentellen Schlaganfallforschung verwendet wird. Es wird angenommen, dass diese Durchgängigkeit des PcomA zur Variabilität der Läsionsgröße bei Mäusen nach Schlaganfallbeiträgt 5. In der Tat, wenn der Blutfluss zur PCA während der MCAO steil abfällt und die PcomA nicht in der Lage ist, einen ausreichenden kollateralen Blutfluss bereitzustellen, kann sich der Schlaganfallinfarkt in das Territorium der PCA ausdehnen. Darüber hinaus führt in diesem Modell eine lange Dauer der Ischämie zu einer höheren Mortalitätswahrscheinlichkeit bei Mäusen. Folglich wird bei Mäusen typischerweise eine kurze MCAO-Dauer von 30-60 Minuten verwendet. Bei den meisten Schlaganfallpatienten kommt es jedoch einige Stunden vor der Reperfusionsbehandlung zu einer Ischämie. Daher ist ein Mausschlagmodell mit einer verlängerten Dauer der Ischämie von hoher klinischer Relevanz.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den ischämischen Schlaganfall bei Mäusen zu modellieren, die einen mittelgroßen Infarkt und eine ausgezeichnete Überlebensrate haben. Dieses transkranielle MCAO-Modell adressiert kritische Merkmale des klinischen Schlaganfalls, da eine verlängerte Ischämie durchgeführt werden kann und ältere Mäuse dieses Modell gut vertragen, was eine langfristige Beurteilung der funktionellen Erholung ermöglicht.

Protocol

Alle in dieser Arbeit beschriebenen Verfahren werden in Übereinstimmung mit den NIH-Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Tieren in der Forschung durchgeführt, und das Protokoll wurde vom Duke Institute Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt. Junge (8-10 Wochen alt) und ältere (22 Monate alte) männliche C57Bl/6-Mäuse wurden für die vorliegende Studie verwendet. Eine Übersicht über dieses Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt. 1. …

Representative Results

Mit einem direkten Blick unter dem Operationsmikroskop kann visuell bestätigt werden, dass der MCA-Blutfluss während der Ischämie blockiert ist. Unsere vorherige Studie zeigte eine >80%ige Verringerung des Blutflusses im ischämischen Bereich mit einem Laser-Doppler-Monitor6. Um Veränderungen des Blutflusses nach MCAO zu bestimmen, kann LSCI verwendet werden, um den ischämischen Insult und die Reperfusion weiter zu bestätigen (Abbildung 1). In <strong class="xfi…

Discussion

Das erste transkranielle MCA-Okklusionsmodell wurde 1981 bei Ratten etabliert 11,12 und1989 durch das MCAO-Modell ohne Kraniektomie ersetzt4. Der initiale transkranielle MCA-Verschluss hatte ein weites Operationsfeld, so dass der gesamte Jochbogen entfernt und die Muskulatur seitlich gezogen wurde. Das lokale Gewebe war nach der Operation geschwollen, was zu Stress und einer verringerten Nahrungsaufnahme für die Tiere führte. In unserem …

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Kathy Gage für ihre redaktionelle Unterstützung. Mit BioRender.com wurden Schemafiguren erstellt. Diese Studie wurde durch Mittel der Abteilung für Anästhesiologie (Duke University Medical Center) und NIH-Zuschüsse (NS099590, HL157354, NS117973 und NS127163) unterstützt.

Materials

0.25% bupivacaine Hospira NDC 0409-1159-18
0.9% sodium chloride ICU Medical NDC 0990-7983-03
2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride (TTC)  Sigma or any available vendor
20 G IV catheter BD 381534 20 GA 1.6 IN
30 G needle BD 305106
4-0 silk suture Look SP116 Black braided silk
8-0 suture with needle  Ethilon 2822G
Alcohol swabs BD 326895
Anesthesia induction box Any suitable vendor Pexiglass make 
Electrical grinder JSDA JD 700
High temperature cautery loop tip Bovie AA03
Isoflurane Covetrus NDC 11695-6777-2
Laser doppler perfusion monitor Moor Instruments moorVMS-LDF1
Lubricant eye ointment Bausch + Lomb 339081
Mouse rectal probe Physitemp RET-3
Nitrous Oxide Airgas UN1070
Otoscope Welchallyn 728 2.5 mm Speculum
Oxygen Airgas UN1072
Povidone-iodine CVS 955338
Recovery box Brinsea  TLC eco
Rimadyl (carprofen) Zoetis 6100701 Injectable 50 mg/mL
Rodent ventilator Harvard Model 683
Temperature controller Physitemp TCAT-2DF 
Triple antibioric & pain relief CVS NDC 59770-823-56
Vaporizer RWD R583S

Referencias

  1. Tsao, C. W., et al. Heart disease and stroke statistics-2022 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 145 (8), e153 (2022).
  2. Nogueira, R. G., et al. Thrombectomy 6 to 24 hours after stroke with a mismatch between deficit and infarct. The New England Journal of Medicine. 378 (1), 11-21 (2018).
  3. Fisher, M., Savitz, S. I. Pharmacological brain cytoprotection in acute ischaemic stroke-renewed hope in the reperfusion era. Nature Reviews Neurology. 18 (4), 193-202 (2022).
  4. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  5. Knauss, S., et al. A semiquantitative non-invasive measurement of PcomA patency in C57BL/6 mice explains variance in ischemic brain damage in filament MCAo. Frontiers in Neuroscience. 14, 576741 (2020).
  6. Yang, Z., et al. Post-ischemia common carotid artery occlusion worsens memory loss, but not sensorimotor deficits, in long-term survived stroke mice. Brain Research Bulletin. 183, 153-161 (2022).
  7. Wang, Z., et al. Increasing O-GlcNAcylation is neuroprotective in young and aged brains after ischemic stroke. Experimental Neurology. 339, 113646 (2021).
  8. Jiang, M., et al. XBP1 (X-box-binding protein-1)-dependent O-GlcNAcylation Is neuroprotective in ischemic stroke in young mice and its impairment in aged mice is rescued by thiamet-G. Stroke. 48 (6), 1646-1654 (2017).
  9. Li, X., et al. Single-cell transcriptomic analysis of the immune cell landscape in the aged mouse brain after ischemic stroke. Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 83 (2022).
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  11. Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 2. Regional cerebral blood flow determined by [14C]iodoantipyrine autoradiography following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 1 (1), 61-69 (1981).
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Sheng, H., Dang, L., Li, X., Yang, Z., Yang, W. A Modified Transcranial Middle Cerebral Artery Occlusion Model to Study Stroke Outcomes in Aged Mice. J. Vis. Exp. (195), e65345, doi:10.3791/65345 (2023).

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