Este protocolo descreve um ensaio de interferência de RNA e ChIP para estudar a herança epigenética do silenciamento induzido por RNAi e modificações associadas da cromatina em C. elegans.
A herança epigenética transgeracional (TEI) permite a transmissão de informações através da linha germinativa sem alterar a sequência do genoma, através de fatores como RNAs não codificantes e modificações na cromatina. O fenômeno da herança de RNA de interferência (RNAi) no nematoide Caenorhabditis elegans é um modelo eficaz para investigar TEI que aproveita o curto ciclo de vida, autopropagação e transparência desse organismo modelo. Na herança de RNAi, a exposição dos animais ao RNAi leva ao silenciamento gênico e assinaturas alteradas de cromatina no locus alvo que persistem por várias gerações na ausência do gatilho inicial. Este protocolo descreve a análise da herança de RNAi em C. elegans usando um repórter de proteína fluorescente verde nuclear (GFP) expressa em linhagem germinativa. O silenciamento do repórter é iniciado alimentando os animais com bactérias que expressam RNA de fita dupla visando a GFP. A cada geração, os animais são passados para manter o desenvolvimento sincronizado, e o silenciamento gênico do repórter é determinado por microscopia. Em gerações selecionadas, populações são coletadas e processadas para imunoprecipitação de cromatina (ChIP)-reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) para medir o enriquecimento de modificação de histonas no locus repórter da GFP. Este protocolo para estudar a herança de RNAi pode ser facilmente modificado e combinado com outras análises para investigar fatores TEI em pequenas vias de RNA e cromatina.
A herança epigenética permite a transmissão de informações reguladoras de genes através de gerações e, portanto, pode permitir que o ambiente ou as experiências dos pais afetem sua progênie. Em C. elegans, o silenciamento gênico germinativo iniciado por RNA exógeno de fita dupla (dsRNA) pode ser herdado por múltiplas gerações em progênies não expostas ao gatilho original 1,2,3,4. Esse processo, denominado herança de interferência de RNA (RNAi), é um dos vários fenômenos de silenciamento epigenético relacionados em C. elegans, incluindo silenciamento multigeracional iniciado por piRNA 2,5, paramutação/RNAe (silenciamento epigenético induzido por RNA)6,7,8 e silenciamento iniciado por array de múltiplas cópias9, que têm requisitos sobrepostos, mas distintos, para pequenas máquinas de regulação de RNA e cromatina . No RNAi exógeno de C. elegans, o dsRNA é processado em pequenos RNAs interferentes (siRNAs) que atuam em um complexo com proteínas primárias de Argonauta para reconhecer seu RNAm alvo. Este alvo leva à amplificação de siRNAs secundários que se associam com Argonautas secundários para silenciar o mRNA alvo através de vias de silenciamento citoplasmático e nuclear. Para alvos de RNAi expressos em linhagem germinativa, o Argonaute HRDE-1 secundário nuclear nuclear e fatores adicionais de RNAi têm como alvo transcritos nascentes, resultando em repressão transcricional e recrutamento de histonas metiltransferases para depositar marcas repressivas de cromatina, incluindo H3K9me310. Histone H3K9me3 promove o estabelecimento do silenciamento hereditário de transgenes de proteína verde fluorescente (GFP) expressa em germinação por herança de RNAi11,12.
O objetivo deste protocolo é usar um transgene expressando uma proteína de fusão GFP-histona na linha germinativa como repórter para herança de RNAi e testar mudanças nas modificações de histonas no locus transgênico repórter usando imunoprecipitação de cromatina e reação em cadeia da polimerase quantitativa (ChIP-qPCR). Este protocolo descreve uma abordagem padronizada de alimentação de RNAi baseada em placas para iniciar o silenciamento do repórter. Também fornece uma linha do tempo detalhada para a passagem de animais entre gerações, isolando embriões in utero de adultos grávidos por tratamento com hipoclorito alcalino (‘branqueamento’). Métodos e dados representativos para monitorar a frequência de silenciamento de GFP em um subgrupo da população por microscopia de fluorescência e para a histona H3K9me3 ChIP-qPCR também são descritos. Ensaios de herança de RNAi baseados em repórteres fornecem um sistema altamente tratável para dissecar funcionalmente os papéis de fatores genéticos e ambientais na regulação epigenética 13,14, e rastreios genéticos usando tais repórteres identificaram tanto genes que são necessários para 2,3,15 quanto genes que regulam negativamente16,17 a duração da herança epigenética transgeracional.
Nesse protocolo, o dsRNA é introduzido pela alimentação, que se tornou um método padrão em C. elegans18. Para ensaios de herança de RNAi, a abordagem alimentar fornece um método fácil para obter uma grande população de P0 2,11,12,22,23,24,25. No entanto, o tempo e a duração da exposição ao RNAi afetam a eficácia do silenciamento transgênico26, e a concentração de bactérias RNAi afeta a persistência do silenciamento hereditário de RNAi1. Portanto, bactérias RNAi padronizadas e o crescimento de vermes são importantes para obter um nível consistente de silenciamento de GFP e duração da herança. Aqui, os embriões são plaqueados em placas de RNAi para que os animais P0 sejam expostos às bactérias RNAi desde a eclosão. Abordagens alternativas têm plaqueado animais sincronizados nos estágios L1 24,27 ouL4 25 em placas RNAi-NGM. Além disso, como a fome e outros estresses afetam a manutenção da herança do RNAi13, os pratos devem ser monitorados para evitar superlotação e esgotamento da oferta de alimentos. Como alternativa para iniciar RNAi por alimentação, alguns dos estudos pioneiros de herança de RNAi de C. elegans induziram RNAi por meio de injeção de gônadas, o que proporciona maior controle da concentração de dsRNA 1,28.
Nesse protocolo, cada geração é passada como uma população com tratamento com hipoclorito alcalino, conforme descrito anteriormente 16,22,23,24. O tratamento com hipoclorito garante que a geração F1 não será contaminada com bactérias RNAi do ambiente parental22 e evita possíveis gargalos populacionais indesejados. No entanto, a passagem em massa também pode ser uma limitação, uma vez que animais individuais podem ter padrões de herança distintos 1,29. Um método alternativo para estabelecer cada geração é selecionar animais individuais 1,2,9,11,25. Essa abordagem permite o rastreamento de fenótipos dentro de linhagens e a incorporação de cruzamentos genéticos. A análise de linhagens também pode ser vantajosa para fenótipos de baixa penetrância12.
A expressão de proteínas fluorescentes é uma leitura poderosa e conveniente do silenciamento induzido por RNAi 2,3,4,12,14,15,16,25,30. Conforme descrito neste protocolo, a expressão da GFP pode ser pontuada manualmente como ON ou OFF 11,12,15,16,25. A pontuação manual pode ser refinada com a atribuição de níveis qualitativos de intensidade 3,4,14. Alternativamente, a pontuação automatizada da intensidade das imagens de microscopia 11,12,14,25,27 ou a medição da fluorescência da citometria de fluxo de animais vivos2 podem fornecer uma leitura quantitativa e de alto rendimento. No entanto, como a expressão do repórter é restrita à linha germinativa, uma ressalva das abordagens automatizadas é que elas também devem diferenciar entre animais com expressão silenciada de GFP versus animais sem linha germinativa, especialmente se o estudo incorporar mutantes com desenvolvimento germinativo anormal. Como alternativa à fluorescência da GFP, a transcrição reversa (RT)-qPCR pode ser usada para quantificar os níveis de RNAi alvo de pré-mRNA e mRNA 2,16,23,24. Esta abordagem fornece uma leitura mais direta do silenciamento, que tem como alvo o RNA, e é especialmente útil para outros alvos de RNAi onde o silenciamento não produz um fenótipo visível. Uma limitação do uso de repórteres artificiais de GFP é que sequências exógenas e endógenas são reguladas diferencialmente em RNAi transgeracional11. Estudos com alvos endógenos, como o alelo letal embrionário sensível à temperatura oma-1(zu405)1,11,16,25, devem, portanto, ser considerados como uma abordagem complementar aos repórteres de transgenes fluorescentes.
A análise de ChIP no contexto de ensaios de herança de RNAi requer comparação entre tratamentos e réplicas. Primeiro, para levar em conta as diferenças no material de partida entre as amostras, o sinal ChIP é normalizado para o sinal de entrada no mesmo locus que a ‘porcentagem de entrada’. O processamento paralelo de uma histona H3 ChIP ajudará a determinar se quaisquer alterações na modificação da histona correspondem a mudanças na densidade nucleossômica. Além disso, como o ChIP é um processo de várias etapas, a eficiência pode variar entre as amostras. A seleção de loci de controle positivo e negativo apropriados é útil para avaliar e comparar a relação sinal-ruído entre amostras e experimentos. Além disso, para facilitar as comparações entre as amostras, os valores do ciclo de limiar de qPCR do DNA ChIP no alvo RNAi são frequentemente normalizados para um locus controle 3,11,15,23,30,31. Para avaliar os efeitos do tratamento com RNAi, a relação do sinal de ChIP em condições de RNAi de tratamento versus controle ou ausência de RNAi também é comparada. Uma limitação da abordagem atual é que o ChIP é realizado com animais inteiros, enquanto a resposta ao tratamento com RNAi pode ser exclusiva da linhagem germinativa. Uma abordagem para superar essa ressalva é realizar ChIP usando núcleos germinativos isolados. Considerações técnicas adicionais para otimizar a ChIP também foram amplamente discutidas em outros estudos32,33.
No geral, esta herança RNAi e protocolo ChIP fornece uma base detalhada e fácil de adaptar que pode ser integrada com outras técnicas para explorar ainda mais a regulação epigenética transgeracional. Por exemplo, bibliotecas de sequenciamento de alto rendimento podem ser construídas a partir do DNA ChIP (ChIP-seq) para uma visão mais detalhada da paisagem da cromatina tanto proximal ao alvo RNAi quanto em escala genômica.
The authors have nothing to disclose.
Gostaríamos de agradecer aos laboratórios da comunidade de C. elegans que desenvolveram e compartilharam as ferramentas e cujo trabalho é citado neste manuscrito. Algumas cepas foram fornecidas pelo CGC, que é financiado pelo NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Este trabalho foi apoiado por uma bolsa do Projeto Canadian Institutes of Health Research (CIHR) para A.L.S. (PJT-175245). C.L. é apoiado por uma bolsa de pós-graduação do Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) (PGS-D).
Agarose | Bioshop | AGA002 | |
Ampicillin | Bioshop | AMP201 | Make a 100 mg/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 °C. |
Anti-H3K9me3 Rabbit Polyclonal Antibody | Abcam | ab8898 | Concentration is batch-dependent (0.9 – 1 mg/mL). |
Anti-Histone H3 Rabbit Polyclonal Antibody | Abcam | ab1791 | Concentration is batch-dependent (0.7 – 1 mg/mL). |
Bleach (6% Sodium hypochlorite) | Lavo | 02358107 | |
C. elegans strain with GFP RNAi Reporter | NA | SX1263 | Sapetschnig et al. 2015 (ref. 7). A gift from E. Miska lab, University of Cambridge. |
Carbenicillin | BioShop | CAR544 | Make a 25 mg/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 °C. |
Dynabeads Protein G Magnetic Beads | Invitrogen | 10003D | |
E. coli strain HT115(DE3) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | HT115(DE3) | |
E. coli strain OP50-1 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50-1 | |
EDTA (0.5 M, pH 8.0) | Invitrogen | 15575020 | |
Fluorescence Stereoscope | Zeiss | Axio Zoom.V16 | |
Formaldehyde (37%) | Sigma | F8775 | |
Glycine | Sigma | 50046 | Make a 1.25 M solution and store at 4 °C. |
HEPES-KOH (1 M, pH 7.5) | Teknova | H1035 | |
Hydrophobic Printed Slides, 10 wells | VWR | 100488-904 | |
IGEPAL CA-630 (Octylphenol ethoxylate) | BioShop | NON999 | Make a 10% (v/v) solution in ultrapure water and store at room temperature. |
IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactoside) | BioShop | IPT001 | Make a 0.2 g/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 °C. |
iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725122 | |
LB Agar Plates supplemented with 100 µg/mL Ampicillin | NA | NA | Standard lab recipe. |
Levamisole (Tetramisole hydrochloride) | Sigma | L9756 | Make a 200 mM solution in ultrapure water. Store at -20 °C. |
LiCl (8 M) | Sigma | L7026 | |
M9 Buffer | NA | NA | 22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl, 1 mM MgSO4. |
Magnetic Separator (1.5 mL tubes) | Applied Biosystems | A13346 | |
Magnetic Separator (0.2 mL tubes) | Permagen | MSR812 | |
Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12541B | |
Microscope Slide | Technologist Choice | LAB-037 | |
NaCl (5 M) | Promega | V4221 | For ChIP buffers. |
NaOH | Sigma | S5881 | Make a 10 M solution and store at room temperature. |
NGM Plates | NA | NA | 1.7% (w/v) agar, 0.3% (w/v) NaCl, 0.25% (w/v) peptone, 1 mM CaCl2, 5 μg/mL cholesterol, 25 mM Potassium phosphate pH 6.0, 1 mM MgSO4, 50 µg/mL streptomycin. |
Normal Rabbit IgG (1 mg/mL) | Cell Signaling Technology | 2729 | |
Petri Dishes (35 mm x 10 mm) | Sarstedt | 82.1135.500 | |
Phosphate Buffered Saline (10X) | Fisher BioReagents | BP3991 | |
Plasmid – Control RNAi | Addgene | L4440 (Plasmid #1654) | |
Plasmid – GFP-targetting RNAi | Addgene | L4417 (Plasmid #1649) | Note, alternative L4440-derived plasmids targeting GFP can be used. |
Primer pair [-3.3 kb upstream of gfp] | Integrated DNA Technologies | NA | F: AAACCAAAGGACGAGAGATTCA, R: GGCTCGATCAAGTAAAATTTCG |
Primer pair [+1.3 kb downstream of gfp] | Integrated DNA Technologies | NA | F: TCGACCAGTTCTAAAGTCACCG, R: ACGTGCGGGATCATTTCTTACT |
Primer pair [clec-18] | Integrated DNA Technologies | NA | F: TGCTCCATGACCTCAACAACA, R: AGTACAGTTCACCGATCCAGA |
Primer pair [gfp exon 1] | Integrated DNA Technologies | NA | F: CTGGAGTTGTCCCAATTCTTGT, R: GGGTAAGTTTTCCGTATGTTGC |
Primer pair [gfp exon 4] | Integrated DNA Technologies | NA | F: GATGGCCCTGTCCTTTTACCA, R: ATGCCATGTGTAATCCCAGCA |
Primer pair [hrp-2] | Integrated DNA Technologies | NA | F: CGTCAACAGGGAGCAGCTG, R: CCTCCGAACTTTCTCTGTCCA |
Protease Inhibitor Cocktail Tablet | Roche | 11836170001 | |
Proteinase K | Bioline | BIO-37084 | |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | CFX96 | |
RNAi-NGM plates | NA | NA | 1.7% (w/v) agar, 0.3% (w/v) NaCl, 0.25% (w/v) peptone, 1 mM CaCl2, 5 µg/mL cholesterol, 25 mM Potassium phosphate buffer pH 6.0, 1 mM MgSO4, 25 µg/mL carbenicillin and 5 mM IPTG. |
RNase A | Sigma | R4642 | |
Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine sodium salt) | Sigma | L5777 | Make a 10% (w/v) solution and store at room temperature protected from light for a maximum of 1 month. |
SDS | Sigma | 74255 | Make a 10% (w/v) solution and store at room temperature. |
Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | Make a 5% (w/v) solution and store at room temperature protected from light for a maximum of 1 month. |
Sonication Tube | Evergreen | 214-3721-010 | |
Sonication Tube Cap | Evergreen | 300-2911-020 | |
Sonicator | Qsonica | Q800R3-110 | |
Streptomycin sulfate | Bioshop | STP101 | Make a 50 mg/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 °C. |
TAE buffer (1X) | NA | NA | 40 mM Tris, 20 mM acetate, 1 mM EDTA |
Tally counter clicker | Uline | H-7350 | |
Tetracycline | Bioshop | TET701 | Make a 5 mg/mL solution in ethanol and store at -20 °C. |
Thermomixer | Eppendorf | 05-400-205 | |
Tris-HCl (1 M, pH 8.0) | Invitrogen | 15568025 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | Make a 10% (v/v) solution in ultrapure water and store at room temperature. |