Cette méthode permet d’éliminer toute invasion majeure lors des injections cellulaires provoquée par la solution de suspension cellulaire.
L’injection directe de cellules dans les tissus est un processus nécessaire dans l’administration cellulaire et/ou la thérapie de remplacement. L’injection cellulaire nécessite une quantité suffisante de solution de suspension pour permettre aux cellules de pénétrer dans le tissu. Le volume de la solution de suspension affecte les tissus, ce qui peut provoquer des lésions invasives majeures à la suite de l’injection de cellules. Cet article fait état d’une nouvelle méthode d’injection cellulaire, appelée injection lente, qui vise à éviter cette blessure. Cependant, l’expulsion des cellules de la pointe de l’aiguille nécessite une vitesse d’injection suffisamment élevée selon la loi de Newton de la force de cisaillement. Pour résoudre la contradiction ci-dessus, un fluide non newtonien, tel qu’une solution de gélatine, a été utilisé comme solution de suspension cellulaire dans ce travail. Les solutions de gélatines sont sensibles à la température, car leur forme passe du gel au sol à environ 20 °C. Par conséquent, pour maintenir la solution de suspension cellulaire sous forme de gel, la seringue a été maintenue au frais dans ce protocole ; Cependant, une fois que la solution a été injectée dans le corps, la température corporelle l’a convertie en sol. L’écoulement du liquide tissulaire interstitiel peut absorber l’excès de solution. Dans ce travail, la technique d’injection lente a permis aux billes cardiomyocytaires de pénétrer dans le myocarde de l’hôte et de se greffer sans fibrose environnante. Cette étude a utilisé une méthode d’injection lente pour injecter des cardiomyocytes néonatals purifiés et en forme de boule de rat dans une zone éloignée d’infarctus du myocarde dans le cœur du rat adulte. À 2 mois après l’injection, les cœurs des groupes transplantés ont montré une amélioration significative de la fonction contractile. De plus, les analyses histologiques des cœurs injectés lentement ont révélé des connexions transparentes entre les cardiomyocytes de l’hôte et du greffon via des disques intercalés contenant des connexions de jonction lacunaire. Cette méthode pourrait contribuer aux thérapies cellulaires de nouvelle génération, en particulier en médecine régénérative cardiaque.
L’administration et le remplacement cellulaires sont de nouvelles stratégies thérapeutiques prometteuses pour les organes fortement endommagés. Parmi ces nouvelles stratégies thérapeutiques, la médecine régénérative cardiaque a fait l’objet d’une attention considérable. Cependant, l’inflammation causée par les blessures médie la formation de cicatrices dans plusieurs organes 1,2,3,4. Le cœur humain se compose d’environ 10 à10 cardiomyocytes ; Par conséquent, théoriquement5,6, il doit être traité avec plus de 109 cardiomyocytes. L’administration d’un grand nombre de cardiomyocytes par des méthodes d’injection traditionnelles peut entraîner des lésions tissulaires importantes7. Cette méthode fournit une nouvelle méthode d’injection cellulaire avec une invasion tissulaire minimale.
L’administration de cellules dans le parenchyme de l’organe nécessite une ou plusieurs injections. Cependant, il existe une divergence dans la mesure où l’injection elle-même peut entraîner des lésions tissulaires. Les lésions tissulaires provoquent une inflammation locale et des cicatrices incurables dans les organes et les tissus, ainsi qu’une altération de la capacité de régénération 8,9,10. Le cœur des mammifères a une propension extrêmement élevée à développer des cicatrices au lieu de se régénérer, car il nécessite une réparation immédiate des blessures afin de supporter l’hypertension artérielle causée par sa fonction de pompage continu11. La thérapie d’ablation utilise cette forte propension à la formation de cicatrices et bloque le circuit susceptible de subir la formation de cicatrices à l’aide d’une arythmie12. Dans une étude précédente, il a été observé que le tissu cicatriciel isolait les cardiomyocytes injectés dans le myocarde de l’hôte. Il s’agit donc de la prochaine cible à surmonter pour obtenir une meilleure efficacité thérapeutique en médecine régénérative cardiaque.
L’écoulement du liquide interstitiel tissulaire joue un rôle essentiel dans le transport de l’oxygène et des nutriments vers les cellules et dans l’élimination des déchets excrétés des cellules. La vitesse physiologique d’écoulement du liquide interstitiel dans chaque tissu/organe est différente (la plage est de 0,01 à 10 μm/s)13. À la connaissance de l’auteur, il n’existe aucune donnée concernant la capacité des tissus/organes individuels à supporter des quantités supplémentaires de liquide sans œdème pathologique ; Cependant, cette expérience tente d’utiliser une vitesse d’injection lente pour éventuellement réduire les lésions tissulaires, et les résultats peuvent être utilisés pour déterminer la praticité de ce concept.
L’un des points critiques de la réussite de la méthode d’injection lente est la préparation d’un système d’injection efficace à l’aide d’un pousse-seringue puissant et d’un tube de transfert de pression solide. Un système à haute pression est nécessaire pour faire sortir le gel de la pointe d’une aiguille fine. Le deuxième point critique est la stabilisation du cœur. Les battements du cœur contre une aiguille d’injection avancée dans le myocarde peuvent blesser les tissus. Dans cette étude, une injection échoguidée a été effectuée pour éviter que les animaux ne subissent une deuxième blessure thoracique ouverte et pour administrer l’injection de cellules dans un cœur stabilisé avec les poumons gonflés. De plus, dans certaines applications destinées à des animaux de grande taille ou à des humains, certains dispositifs d’injection fixés sur le cœur doivent être pris en compte dans le cadre de la conception stratégique de l’application. Pour les injections thoraciques ouvertes dans le cœur des petits animaux, l’utilisation d’une aiguille longue et flexible est recommandée compte tenu de leur fréquence cardiaque plus élevée.
Dans ce travail, la méthode d’injection lente a considérablement augmenté le volume des cardiomyocytes survivants par rapport à la méthode d’injection normale. L’injection normale provoque des dommages cellulaires par contrainte de cisaillement15. En revanche, la méthode d’injection lente ne provoque pas de telles contraintes théoriquement car elle utilise une solution non newtonienne en plus de l’injection lente.
En termes de fibrose locale, l’espace interstitiel autour des cardiomyocytes survivants normalement injectés a montré un dépôt de collagène de type I fort et généralisé. En revanche, les signaux de collagène de type I autour des cardiomyocytes greffés à l’aide de la méthode d’injection lente étaient beaucoup plus faibles et plus limités. Cela suggère que la méthode d’injection lente a causé beaucoup moins de dégâts. L’injection lente de cardiomyocytes néonatals dans le myocarde adulte a considérablement amélioré la fonction contractile du cœur infarcat. Les analyses histologiques ont suggéré que la greffe des cardiomyocytes à l’aide de la méthode d’injection lente a permis d’obtenir des connexions directes et un couplage fonctionnel avec les cardiomyocytes de l’hôte. Ce phénomène explique le mécanisme de récupération fonctionnelle du myocarde de l’hôte. À notre connaissance, il s’agit du premier rapport de cardiomyocytes néonatals greffés avec des connexions transparentes à grande échelle avec les cardiomyocytes adultes hôtes. Les connexions fonctionnelles avec le myocarde de l’hôte via un couplage électrique et mécanique peuvent faire mûrir les cardiomyocytes greffés et leur permettre d’agir comme des myocytes fonctionnels qui contribuent à la fonction cardiaque de l’hôte. Les interactions de force physique à long terme entre l’hôte et les cardiomyocytes du greffon sont cruciales pour une maturation complète. Par conséquent, 2 mois après l’injection peuvent être nécessaires pour la récupération fonctionnelle du cœur infarcat. La récupération de la fonction cardiaque du patient en fonction du temps peut être un phénomène attendu dans les applications thérapeutiques, ce qui peut être une caractéristique de l’établissement réussi d’un couplage fonctionnel de novo et d’une intégration entre l’hôte et les cardiomyocytes greffés.
La méthode d’injection lente peut être réalisée lors d’une chirurgie thoracique ouverte. De plus, cette méthode peut être appliquée aux souris. Pour de futures applications en thérapie humaine, nous devons encore résoudre plusieurs problèmes. La vitesse d’injection doit être optimisée en tenant compte de la capacité tampon de l’écoulement du liquide interstitiel dans chaque organe cible humain. Des matériaux exempts de xéno, tels que la gélatine humaine ou des matériaux synthétiques biodégradables, doivent être appliqués. Des appareils d’injection lente de qualité GMP, tels que des outils jetables compacts spécifiques à un organe ou un appareil réutilisable applicable aux organes larges, devraient être développés.
The authors have nothing to disclose.
Cette étude a été financée par une subvention de JSPS KAKENHI (subvention n° 23390072 et 19K07335) et AMED (subvention n° A-149).
18-gauge needle & tuberculin, 1 mL | Terumo | NN1838R, SS-01T | |
29-gauge 50 mm-long needle | Ito Corporation, Tokyo, Japan | 14903 Type-A | |
A copper tube | General Suppliers | outer diameter, 1 mm; inner diameter, 0.3 mm; thickness, 0.35 mm | |
Ads Buffer | Each ingredient was purchased from Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | Hand made, Composition: 116 mM NaCl, 20 mM HEPES, 12.5 mM NaH2PO4, 5.6 mM glucose, 5.4 mM KCl, 0.8 mM MgSO4, pH 7.35 | |
alpha-MEM | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 051-07615 | |
Anti-collagen type I rabbit polyclonal antibody (H+L) | Proteintech | 14695-1-AP | using dilution 1:100 |
Anti-Connexin-43 rabbit polyclonal antibody (H+L) | Sigma Aldrich | C6219 | using dilution 1:100 |
Anti-rabbit IgG (H+L) donley polyclonal antibody-AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21206 | using dilution 1:300 |
blocking solution (Blocking One) | Nacalai Tesque, Kyoto, Japan | 03953-95 | |
collagenase | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 034-22363 | |
confocal laser microscope | Carl Zeiss Inc., Oberkochen, Germany | LSM510 META | |
DNase I | Sigma-Aldrich | DN25 | |
FACS Aria III | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA | ||
fetal bovine serum | BioWest, FL, USA | S1820-500 | |
fine movement device (Micromanipulator) | Narishige Co., Ltd., Tokyo, Japan | M-44 | |
fluorescence microscope | Nikon Instruments, Tokyo, Japan | Eclipse Ti2 | |
gelatin from bovine skin | Sigma-Aldrich | G9382 | dissolving in PBS (-) to 10%, and autoclaving it |
Neonatal Sprague-Dawley (SD) rats | Japan SLC Inc., Shizuoka, Japan | 0–2 d after birth | |
non-adhesive 96-well plates (spheloid plate) | Sumitomo Bakelite, Tokyo, Japan | MS-0096S | |
Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | Sakura Finetek USA, Inc., CA, USA | Tissue-Tek OCT compound | |
peristaltic pump (for cooling system) | As One Co., Osaka, Japan | SMP-23AS | |
PKH26 | Sigma-Aldrich | PKH26GL | |
Stir Bar, Micro, Magnetic, PTFE, Length x Dia. in mm: 5 x 2 | Chemglass life sciences LLC, NJ, USA | CG-2003-120 | |
syringe | Ito Corporation, Tokyo, Japan | MS-N25 | |
syringe pump with remote controller | As One Co., Osaka, Japan | MR-1, CT-10 | |
tetramethylrhodamine methyl ester | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | T668 | |
trypsin | DIFCO, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA | 215240 | |
Tween-20 | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 167-11515 | |
veterinarian ointment | Fujita Pharmaceutical Co., Ltd. | Hibikusu ointment #WAK-95832 | |
Vevo 2100 Imaging System | Fujifilm VisualSonics, Inc., Toronto, Canada | Vevo 2100 | |
Vevo 2100 Imaging System software version 1.0.0 | Fujifilm VisualSonics, Inc., Toronto, Canada | Vevo 2100 | |
Weakly curved needle with ophthalmic thread | Natsume Seisakusho Co., Ltd., Tokyo, Japan | C7-70 |