Summary

Verhaltenscharakterisierung eines Angelman-Syndrom-Mausmodells

Published: October 20, 2023
doi:

Summary

Dieses Manuskript stellt eine Reihe von hochgradig reproduzierbaren Verhaltenstests vor, um ein Mausmodell mit Angelman-Syndrom zu validieren.

Abstract

Dieses Manuskript beschreibt eine Reihe von Verhaltenstests, die zur Charakterisierung des Angelman-Syndroms (AS)-ähnlichen Phänotypen in einem etablierten Mausmodell der AS zur Verfügung stehen. Wir verwenden das Rotarod-Lernparadigma, eine detaillierte Ganganalyse und einen Nestbautest, um motorische Beeinträchtigungen bei Tieren zu erkennen und zu charakterisieren. Wir testen die Emotionalität der Tiere im Freiland- und erhöhten Plus-Labyrinth-Tests, sowie die Wirkung im Schwanzaufhängungstest. Wenn AS-Mäuse im Freilandversuch getestet werden, sollten die Ergebnisse mit Vorsicht interpretiert werden, da motorische Dysfunktionen das Verhalten der Mäuse im Labyrinth beeinflussen und die Aktivitätswerte verändern.

Die Reproduzierbarkeit und Wirksamkeit der vorgestellten Verhaltenstests wurde bereits in mehreren unabhängigen Uba3a-Mauslinien mit unterschiedlichen Knockout-Varianten validiert, was diese Testreihe als hervorragendes Validierungswerkzeug in der AS-Forschung etabliert. Modelle mit entsprechender Konstrukt- und Gesichtsvalidität werden weitere Untersuchungen zur Aufklärung der Pathophysiologie der Erkrankung und zur Entwicklung kausaler Therapien rechtfertigen.

Introduction

Das Angelman-Syndrom (AS) ist eine seltene neurologische Entwicklungsstörung. Der häufigste genetische Ursprung von AS ist eine große Deletion der 15q11-q13-Region des mütterlichen Chromosoms, die bei fast 74 % der Patienten gefunden wird1. Die Deletion dieser Region führt zum Verlust von UBE3A, dem Hauptverursacher von AS, das für eine E3-Ubiquitin-Ligase kodiert. Das väterliche Allel des UBE3A-Gens in Neuronen wird in einem Prozess stillgelegt, der als Prägung bezeichnet wird. Folglich erlaubt die väterliche Prägung des Gens nur die mütterliche Expression im Zentralnervensystem (ZNS)2. Daher führt die Deletion des UBE3A-Gens vom mütterlichen Chromosom zur Entwicklung von AS-Symptomen. Beim Menschen manifestiert sich AS im Alter von etwa 6 Monaten, mit einer Entwicklungsverzögerung, die in allen Entwicklungsstadien anhält und bei den betroffenen Personen zu schweren schwächenden Symptomen führt 3,4. Zu den Kernsymptomen der Störung gehören das Defizit der Fein- und Grobmotorik, einschließlich ruckartiger ataktischer Gang, schwere Sprachstörungen und geistige Behinderung. Etwa 80% der AS-Patienten leiden zudem unter Schlafstörungen und Epilepsie. Bisher gibt es nur symptomatische Medikamente, die epileptische Anfälle reduzieren und die Schlafqualität verbessern1. Daher wird die Entwicklung robuster Tiermodelle mit reproduzierbaren Verhaltensphänotypen zusammen mit einer verfeinerten Phänotypisierungsanalyse unerlässlich sein, um die pathophysiologischen Mechanismen der Störung aufzuklären und wirksame Medikamente und Behandlungen zu finden.

Die Komplexität der menschlichen Erkrankung, die das ZNS betrifft, erfordert, dass Modellorganismen ein vergleichbares Genom, eine vergleichbare Physiologie und ein vergleichbares Verhalten besitzen. Mäuse sind aufgrund ihres kurzen Fortpflanzungszyklus, ihrer geringen Größe und ihrer relativ einfachen DNA-Modifikation als Modellorganismus beliebt. Im Jahr 1984 schlug Paul Willner drei grundlegende Validierungskriterien für Krankheitsmodelle vor: das Konstrukt, das Gesicht und die prädiktive Validität, die verwendet werden, um den Wert des Modells zu bestimmen5. Vereinfacht gesagt, spiegelt die Konstruktvalidität die biologischen Mechanismen wider, die für die Entwicklung der Störung verantwortlich sind, die Gesichtsvalidität rekapituliert ihre Symptome und die prädiktive Validität beschreibt das Ansprechen des Modells auf therapeutische Medikamente.

Um den oben genannten Prinzipien gerecht zu werden, haben wir die häufigste genetische Ätiologie, eine große Deletion des mütterlichen 15q11.2-13q-Locus einschließlich des UBE3A-Gens, gewählt, um AS-Modellmäuse zu erzeugen. Wir verwendeten die CRISPR/Cas9-Technik, um eine 76.225 bp lange Region zu löschen, die sich über das gesamte UBE3A-Gen erstreckt und sowohl die kodierenden als auch die nicht-kodierenden Elemente des Gens umfasst, in Mäusen aus einem C57BL/6N-Hintergrund6. Anschließend haben wir die Tiere gezüchtet, um UBE3A+/− heterozygote Mäuse zu erhalten. Für die Gesichtsvalidierung des Modells verwendeten wir Tiere aus Kreuzungen von UBE3A+/−-Weibchen und Wildtyp-Männchen, um UBE3A+/- Nachkommen (Stamm mit der Bezeichnung C57BL/6NCrl-UBE3A/Ph und später als UBE3A mGenedel/+ bezeichnet) und Kontrollwurfgeschwister zu gewinnen. Wir testeten ihre Fein- und Grobmotorik, ihre Emotionalität und ihren Affekt, um die Kernsymptome des AS zu rekapitulieren. In einem früheren Artikel haben wir auch die kognitiven Funktionen der Tiere untersucht, da AS-Patienten auch an einer geistigen Behinderung leiden6. Wir fanden jedoch keine kognitiven Beeinträchtigungen bei UBE3AmGenedel/+ Mäusen, was möglicherweise auf das junge Alter der Tiere zum Zeitpunkt des Versuchs zurückzuführenist 7. Eine spätere Untersuchung der älteren Tiere, die etwa 18 Wochen alt waren, ergab ein Defizit in der Verhaltensflexibilität während des Umkehrlernens im Ortspräferenzparadigma. Die Komplexität der für diese Analyse verwendeten Geräte erfordert jedoch ein separates methodisches Modul, das hier nicht enthalten ist.

Die hier vorgestellten Verhaltenstests gehören dank ihres hohen prädiktiven Wertes und ihrer ausreichenden Konstruktvalidität zu den gängigen Phänotypisierungswerkzeugen in der Genforschung 8,9,10. Wir nutzten diese Tests, um ein Mausmodell für AS zu validieren, indem wir die Kernsymptome der menschlichen Krankheit auf reproduzierbare, altersunabhängige Weise rekapitulierten. Die Emotionalität des Tieres wurde im erhöhten Plus-Labyrinth und im Freifeldversuch bewertet. Beide Tests basieren auf dem Annäherungs-Vermeidungs-Konflikt, bei dem die Tiere auf der Suche nach Nahrung, Unterschlupf oder Paarungsmöglichkeiten eine neue Umgebung erkunden und gleichzeitig angstlösende Kompartimente meiden11. Zusätzlich wird der Freilandtest verwendet, um die Bewegungsaktivität einer Maus zu testen8. Der Schwanzsuspensionstest wird häufig in der Depressionsforschung eingesetzt, um nach neuen Antidepressiva oder depressiven Phänotypen in Maus-Knockout-Modellen zu suchen12. Dieser Test bewertet die Verzweiflung, die Tiere im Laufe der Zeit in einer unentrinnbaren Situation entwickeln. Motorisches Lernen und detaillierte Gangeigenschaften wurden auf dem Rotarod bzw. im DigiGait bestimmt. Die Ausdauer des Tieres auf dem beschleunigenden Stab charakterisiert seine Gleichgewichts- und Bewegungskoordinationsfähigkeiten, während die detaillierte Analyse der Schrittmuster einer Maus eine sensible Bewertung neuromuskulärer Beeinträchtigungen im Zusammenhang mit vielen neurogenerativen Bewegungsstörungen darstellt13,14,15. Der Nestlet-Zerkleinerungstest ist Teil der Standardmethodik zur Erkennung impulsiven Verhaltens bei Nagetieren, und da er das natürliche Bauverhalten von Nagetieren nutzt, zeigt er das Wohlbefinden des Tieres an16,17.

Die Größe der Versuchsgruppen war das Ergebnis eines Kompromisses, um die Anforderungen der 3R-Regel zu erfüllen und die Zuchtleistung der Kolonien effizient zu nutzen. Um jedoch eine statistische Aussagekraft zu erhalten, hatten die Gruppen nicht weniger als 10 Individuen, da eine ausreichende Anzahl von Brutpaaren gebildet wurde. Leider führte die Zuchtleistung nicht immer zu einer ausreichenden Anzahl von Tieren.

Protocol

Alle Tiere und Experimente, die in dieser Studie verwendet wurden, wurden einer ethischen Überprüfung unterzogen und in Übereinstimmung mit der europäischen Richtlinie 2010/63/EU durchgeführt. Die Studie wurde von der Tschechischen Zentralkommission für Tierschutz genehmigt. Die Mäuse wurden in einzeln belüfteten Käfigen untergebracht und bei einer konstanten Temperatur von 22 ± 2 °C mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus gehalten. Die Mäuse wurden ad libitum mit Mäusefutter und Wasser versorgt….

Representative Results

Erhöhte Plus-, Labyrinth- und FreifeldtestsDie EPM- und OF-Tests nutzen die natürliche Neigung von Nagetieren, neue Umgebungen zu erkunden18,19. Die Erkundung wird von einem Annäherungs-Vermeidungs-Konflikt bestimmt, bei dem Nagetiere zwischen der Erkundung einer neuen Umgebung und der Vermeidung möglicher Gefahren wählen. Tiere erkunden unbekannte Orte auf der Suche nach Unterschlupf, sozialen Kontakten oder Nahrungssuche. Neue Orte kö…

Discussion

AS-Modelle, die in verschiedenen murinen Stämmen erstellt wurden, werden in der Regel mit Tests des emotionalen Zustands, der motorischen Funktionen und der kognitiven Fähigkeiten von Tieren validiert, um den Vergleich mit menschlichen Symptomen zu erleichtern31,32. Ein motorisches Defizit in AS-Modellen ist der konsistenteste Befund in allen Laboren, gefolgt von einem unveränderten Emotionalitätszustand der Mutanten und Schwierigkeiten beim Nesterbau<sup cla…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Forschung wurde von der Tschechischen Akademie der Wissenschaften RVO 68378050, LM2018126 Tschechischen Zentrum für Phänogenomik von MEYS CR, OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001789 (Upgrade des Tschechischen Zentrums für Phänogenomik: Entwicklung hin zur Translationsforschung durch MEYS und ESIF), OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015861 (CCP Infrastructure Upgrade II von MEYS und ESIF) und OP RDI CZ.1.05/2.1.00/19.0395 (höhere Qualität und Kapazität für transgene Modelle durch MEYS und EFRE) unterstützt. Darüber hinaus wurde diese Studie von der NGO “Association of Gene Therapy (ASGENT)”, Tschechien (https://asgent.org/) und LM2023036 Tschechischen Zentrum für Phänogenomik finanziert, das vom Ministerium für Bildung, Jugend und Sport der Tschechischen Republik zur Verfügung gestellt wird.

Materials

Cages, individually ventilated Techniplast
DigiGait Mouse Specifics, Inc., 2 Central Street Level
Unit 110
Framingham, MA 01701, USA
Equipment was tendered, no catalogue  number was provided, nor could be find on company's web site Detailed analysis of mouse gait, hardware and software provided. 
FDA Nestlet squares Datesand Ltd., 7 Horsfield Way, Bredbury, Stockport SK6, UK Material was bought from Velaz vendor via direct email request. Velaz do not provide any catalogue no. Cotton nestlets for nest building test. Nestlet discription: 2-3 g each, with diameter around 5 x 5 x 0.5cm.
Mouse chow Altramion
Rotarod TSE Systems GmbH, Barbara-McClintock-Str.4
12489 Berlin, Germany
Equipment was tendered, no catalogue  number was provided, nor could be find on company's web site Rotarod for 5 mice, hardware and software provided. Drum dimensions: Diameter: 30 mm, width per lane: 50 mm, falling distance 147 mm.
Tail Suspension Test Bioseb, In Vivo Research Instruments, 13845 Vitrolles
FRANCE
Reference: BIO-TST5 Fully automated equipment for immobility time evaluation of 3 mice hanged by tail, hardware and software provided
Transpore medical tape Medical M, Ltd. P-AIRO1291 The tape used to attach an animal to the hook by its tail.
Viewer – Video Tracking System Biobserve GmbH, Wilhelmstr. 23 A
53111 Bonn, Germany
Equipment with software were tendered, no catalogue  number was provided, nor could be find on company's web site Software with custom made hardware: maze, IR base, IR sensitive cameras. Custom-made OF dimensions: 42 x 42 cm area, 49 cm high wall, central zone area: 39 cm2. A custom-made EPM was elevated 50 cm above the floor, with an open arm 79 cm long,  9 cm wide, and closed arm 77 cm long, 7.6 cm wide. 

Referencias

  1. Kalsner, L., Chamberlain, S. J. Prader-Willi, Angelman, and 15q11-q13 duplication syndromes. Pediatric Clinics of North America. 62 (3), 587-606 (2015).
  2. Yamasaki, K., et al. Neurons but not glial cells show reciprocal imprinting of sense and antisense transcripts of Ube3a. Human Molecular Genetics. 12 (8), 837-847 (2003).
  3. Clayton-Smith, J., Laan, L. Angelman syndrome: a review of the clinical and genetic aspects. Journal of Medical Genetics. 40 (2), 87-95 (2003).
  4. Jolleff, N., Ryan, M. M. Communication development in Angelman’s syndrome. Archives of Disease in Childhood. 69 (1), 148-150 (1993).
  5. Willner, P. The validity of animal models of depression. Psychopharmacology. 83 (1), 1-16 (1984).
  6. Syding, L. A., et al. Generation and characterization of a novel Angelman syndrome mouse model with a full deletion of the Ube3a gene. Cells. 11 (18), 2815 (2022).
  7. Huang, H. -. S., et al. Behavioral deficits in an Angelman syndrome model: effects of genetic background and age. Behavioural Brain Research. 243, 79-90 (2013).
  8. Choleris, E., Thomas, A. W., Kavaliers, M., Prato, F. S. A detailed ethological analysis of the mouse open field test: effects of diazepam, chlordiazepoxide and an extremely low frequency pulsed magnetic field. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 25 (3), 235-260 (2001).
  9. Cryan, J. F., Mombereau, C., Vassout, A. The tail suspension test as a model for assessing antidepressant activity: review of pharmacological and genetic studies in mice. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 29 (4-5), 571-625 (2005).
  10. Walf, A. A., Frye, C. A. The use of the elevated plus maze as an assay of anxiety-related behavior in rodents. Nature Protocols. 2 (2), 322-328 (2007).
  11. Carola, V., D’Olimpio, F., Brunamonti, E., Mangia, F., Renzi, P. Evaluation of the elevated plus-maze and open-field tests for the assessment of anxiety-related behaviour in inbred mice. Behavioural Brain Research. 134 (1-2), 49-57 (2002).
  12. Yan, H. -. C., Cao, X., Das, M., Zhu, X. -. H., Gao, T. -. M. Behavioral animal models of depression. Neuroscience Bulletin. 26 (4), 327-337 (2010).
  13. Preisig, D. F., et al. High-speed video gait analysis reveals early and characteristic locomotor phenotypes in mouse models of neurodegenerative movement disorders. Behavioural Brain Research. 311, 340-353 (2016).
  14. Knippenberg, S., Thau, N., Dengler, R., Petri, S. Significance of behavioural tests in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Behavioural Brain Research. 213 (1), 82-87 (2010).
  15. Farr, T. D., Liu, L., Colwell, K. L., Whishaw, I. Q., Metz, G. A. Bilateral alteration in stepping pattern after unilateral motor cortex injury: a new test strategy for analysis of skilled limb movements in neurological mouse models. Journal of Neuroscience Methods. 153 (1), 104-113 (2006).
  16. Jirkof, P. Burrowing and nest building behavior as indicators of well-being in mice. Journal of Neuroscience Methods. 234, 139-146 (2014).
  17. Wulaer, B., et al. Repetitive and compulsive-like behaviors lead to cognitive dysfunction in Disc1Δ2-3/Δ2-3 mice. Genes, Brain, and Behavior. 17 (8), 12478 (2018).
  18. Glickman, S. E., Hartz, K. E. Exploratory behavior in several species of rodents. Journal of Comparative and Physiological Psychology. 58, 101-104 (1964).
  19. La-Vu, M., Tobias, B. C., Schuette, P. J., Adhikari, A. To approach or avoid: an introductory overview of the study of anxiety using rodent assays. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 14, 145 (2020).
  20. Karolewicz, B., Paul, I. A. Group housing of mice increases immobility and antidepressant sensitivity in the forced swim and tail suspension tests. European Journal of Pharmacology. 415 (2-3), 197-201 (2001).
  21. Liu, X., Gershenfeld, H. K. Genetic differences in the tail-suspension test and its relationship to imipramine response among 11 inbred strains of mice. Biological Psychiatry. 49 (7), 575-581 (2001).
  22. Dunham, N. W., Miya, T. S. A note on a simple apparatus for detecting neurological deficit in rats and mice. Journal of the American Pharmaceutical Association. 46 (3), 208-209 (1957).
  23. Dorman, C. W., Krug, H. E., Frizelle, S. P., Funkenbusch, S., Mahowald, M. L. A comparison of DigiGait and TreadScan imaging systems: assessment of pain using gait analysis in murine monoarthritis. Journal of Pain Research. 7, 25-35 (2013).
  24. Stroobants, S., Gantois, I., Pooters, T., D’Hooge, R. Increased gait variability in mice with small cerebellar cortex lesions and normal rotarod performance. Behavioural Brain Research. 241, 32-37 (2013).
  25. Vandeputte, C., et al. Automated quantitative gait analysis in animal models of movement disorders. BMC Neuroscience. 11, 92 (2010).
  26. Amende, I., et al. Gait dynamics in mouse models of Parkinson’s disease and Huntington’s disease. Journal of Neuroengineering and Rehabilitation. 2, 20 (2005).
  27. Hampton, T. G., et al. Gait disturbances in dystrophic hamsters. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 235354 (2011).
  28. Vinsant, S., et al. Characterization of early pathogenesis in the SOD1(G93A) mouse model of ALS: part I, background and methods. Brain and Behavior. 3 (4), 335-350 (2013).
  29. Li, X., Morrow, D., Witkin, J. M. Decreases in nestlet shredding of mice by serotonin uptake inhibitors: comparison with marble burying. Life Sciences. 78 (17), 1933-1939 (2006).
  30. Murphy, M., et al. Chronic adolescent Δ9-tetrahydrocannabinol treatment of male mice leads to long-term cognitive and behavioral dysfunction, which are prevented by concurrent cannabidiol treatment. Cannabis and Cannabinoid Research. 2 (1), 235-246 (2017).
  31. Sonzogni, M., et al. A behavioral test battery for mouse models of Angelman syndrome: A powerful tool for testing drugs and novel Ube3a mutants. Molecular Autism. 9, 47 (2018).
  32. Dodge, A., et al. Generation of a novel rat model of Angelman syndrome with a complete Ube3a gene deletion. Autism Research. 13 (3), 397-409 (2020).
  33. Born, H. A., et al. Strain-dependence of the Angelman syndrome phenotypes in Ube3a maternal deficiency mice. Scientific Reports. 7 (1), 8451 (2017).
  34. File, S. E., Mabbutt, P. S., Hitchcott, P. K. Characterisation of the phenomenon of "one-trial tolerance" to the anxiolytic effect of chlordiazepoxide in the elevated plus-maze. Psychopharmacology. 102 (1), 98-101 (1990).
  35. Liu, N., et al. Single housing-induced effects on cognitive impairment and depression-like behavior in male and female mice involve neuroplasticity-related signaling. The European Journal of Neuroscience. 52 (1), 2694-2704 (2020).
  36. Ueno, H., et al. Effects of repetitive gentle handling of male C57BL/6NCrl mice on comparative behavioural test results. Science Reports. 10 (1), 3509 (2020).
  37. Rodgers, R. J., Dalvi, A. Anxiety, defence and the elevated plus-maze. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 21 (6), 801-810 (1997).
  38. Deacon, R. M. J., Penny, C., Rawlins, J. N. P. Effects of medial prefrontal cortex cytotoxic lesions in mice. Behavioural Brain Research. 139 (1-2), 139-155 (2003).
  39. Fernagut, P. O., Diguet, E., Labattu, B., Tison, F. A simple method to measure stride length as an index of nigrostriatal dysfunction in mice. Journal of Neuroscience Methods. 113 (2), 123-130 (2002).
  40. Wooley, C. M., Xing, S., Burgess, R. W., Cox, G. A., Seburn, K. L. Age, experience and genetic background influence treadmill walking in mice. Physiology & Behavior. 96 (2), 350-361 (2009).
  41. Lakes, E. H., Allen, K. D. Gait analysis methods for rodent models of arthritic disorders: reviews and recommendations. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (11), 1837-1849 (2016).
  42. Deuis, J. R., Dvorakova, L. S., Vetter, I. Methods used to evaluate pain behaviors in rodents. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 284 (2017).
  43. Tanas, J. K., et al. Multidimensional analysis of behavior predicts genotype with high accuracy in a mouse model of Angelman syndrome. Translational Psychiatry. 12 (1), 426 (2022).
  44. Silva-Santos, S., et al. Ube3a reinstatement identifies distinct developmental windows in a murine Angelman syndrome model. The Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 2069-2076 (2015).
  45. Milazzo, C., et al. Antisense oligonucleotide treatment rescues UBE3A expression and multiple phenotypes of an Angelman syndrome mouse model. JCI Insight. 6 (15), e145991 (2021).

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Kubik-Zahorodna, A., Prochazka, J., Sedlacek, R. Behavioral Characterization of an Angelman Syndrome Mouse Model. J. Vis. Exp. (200), e65182, doi:10.3791/65182 (2023).

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