Hier beschreiben wir eine magnetische Hochgeschwindigkeitspinzette, die nanomechanische Messungen an kraftsensitiven Biomolekülen mit einer maximalen Rate von 1,2 kHz durchführt. Wir stellen seine Anwendung auf DNA-Haarnadeln und SNARE-Komplexe als Modellsysteme vor, aber es wird auch auf andere Moleküle anwendbar sein, die an mechanobiologischen Ereignissen beteiligt sind.
Einzelmolekül-Magnetpinzetten (MTs) haben sich als leistungsstarke Werkzeuge zur gewaltsamen Abfrage von Biomolekülen wie Nukleinsäuren und Proteinen erwiesen und sind daher bereit, auf dem Gebiet der Mechanobiologie nützlich zu sein. Da die Methode in der Regel auf bildbasiertem Tracking von magnetischen Beads beruht, haben die Geschwindigkeitsbegrenzung bei der Aufnahme und Analyse von Bildern sowie die thermischen Fluktuationen der Beads ihre Anwendung bei der Beobachtung kleiner und schneller struktureller Veränderungen in Zielmolekülen lange Zeit behindert. Dieser Artikel beschreibt detaillierte Methoden für den Aufbau und Betrieb eines hochauflösenden MT-Aufbaus, der die nanoskalige Millisekundendynamik von Biomolekülen und ihren Komplexen auflösen kann. Als Anwendungsbeispiele werden Experimente mit DNA-Haarnadeln und SNARE-Komplexen (Membranfusionsmaschinerie) demonstriert, wobei der Schwerpunkt darauf liegt, wie deren transiente Zustände und Übergänge in Gegenwart von Kräften auf der Piconewton-Skala detektiert werden können. Wir gehen davon aus, dass Hochgeschwindigkeits-MTs weiterhin hochpräzise nanomechanische Messungen an Molekülen ermöglichen werden, die Kräfte in Zellen wahrnehmen, übertragen und erzeugen, und damit unser Verständnis der Mechanobiologie auf molekularer Ebene vertiefen werden.
Zellen nehmen mechanische Reize aktiv wahr und reagieren darauf. Dabei weisen viele Biomoleküle kraftabhängige Eigenschaften auf, die dynamische Strukturveränderungen ermöglichen. Bekannte Beispiele sind mechanosensitive Ionenkanäle und Zytoskelettelemente, die den Zellen wichtige mechanische Informationen aus ihrer Umgebung liefern.
Darüber hinaus können Moleküle, die eine einzigartige krafttragende Natur aufweisen, auch als mechanosensitiv im weiteren Sinne angesehen werden. Zum Beispiel spielen die lokale Bildung und das Schmelzen von Nukleinsäure-Duplexen sowie Strukturen höherer Ordnung wie G-Quadruplexe eine entscheidende Rolle bei der Replikation, Transkription, Rekombination und neuerdings auch bei der Genom-Editierung. Darüber hinaus erfüllen einige neuronale Proteine, die an der synaptischen Kommunikation beteiligt sind, ihre Funktionen, indem sie physikalische Kräfte erzeugen, die über das Niveau typischer intermolekularer Interaktionen hinausgehen. Unabhängig davon, welches Beispiel man untersucht, wird sich die Untersuchung der Nanomechanik der beteiligten Biomoleküle mit hoher raumzeitlicher Präzision als äußerst nützlich erweisen, um molekulare Mechanismen der damit verbundenen mechanobiologischen Prozesse aufzudecken 1,2,3.
Einzelmolekül-Kraftspektroskopie-Methoden haben sich als leistungsstarke Werkzeuge erwiesen, um die mechanischen Eigenschaften der Biomoleküle 2,4,5,6 zu untersuchen. Sie können strukturelle Veränderungen in Nukleinsäuren und Proteinen gleichzeitig mit Krafteinwirkung beobachten und so kraftabhängige Eigenschaften untersuchen. Zwei bekannte Aufbauten sind optische Pinzetten und magnetische Pinzetten (MTs), die mikrometergroße Kügelchen verwenden, um die Moleküle 5,6,7,8 zu manipulieren. In diesen Plattformen werden Polystyrol (für optische Pinzetten) oder magnetische Kügelchen (für MTs) über molekulare “Griffe”, die typischerweise aus kurzen Fragmenten doppelsträngiger DNA (dsDNA) bestehen, an Zielmoleküle (z. B. Nukleinsäuren und Proteine) gebunden. Die Kügelchen werden dann bewegt, um Kraft auszuüben, und abgebildet, um ihre Positionen zu verfolgen, die über strukturelle Veränderungen in den Zielmolekülen berichten. Optische und magnetische Pinzetten sind in ihren Anwendungen weitgehend austauschbar, aber es gibt wichtige Unterschiede in ihren Ansätzen zur Kraftkontrolle. Optische Pinzetten sind intrinsische Positionsklemminstrumente, die Perlen in Position halten, wodurch die aufgebrachte Kraft schwankt, wenn sich die Form eines Zielkonstrukts ändert. Eine Verlängerungserhöhung, z. B. durch Entfaltung, lockert das Seil und verringert die Spannung und umgekehrt. Obwohl aktives Feedback implementiert werden kann, um die Kraft in optischen Pinzetten zu steuern, arbeiten MTs im Gegensatz dazu natürlich als Kraftklemmvorrichtung und nutzen die stabilen Fernfeld-Magnetkräfte von Permanentmagneten, die auch Umgebungsstörungen standhalten können.
Trotz ihrer langen Geschichte und ihres einfachen Designs sind MTs bei ihren Anwendungen für hochpräzise Messungen hinter optischen Pinzetten zurückgeblieben, was vor allem auf die technischen Herausforderungen bei der schnellen Perlenverfolgung zurückzuführen ist. In jüngster Zeit haben jedoch mehrere Gruppen gemeinsam eine vielschichtige Verbesserung sowohl der Hard- als auch der Software für MT-Instrumente 2,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 durchgeführt . In dieser Arbeit stellen wir ein Beispiel für einen solchen Aufbau vor, der bei 1,2 kHz läuft, und beschreiben, wie man damit nanomechanische Messungen an kraftempfindlichen Biomolekülen durchführen kann. Als Modellsysteme verwenden wir DNA-Haarnadeln und neuronale SNARE-Komplexe und untersuchen deren schnelle, strukturelle Veränderungen im Piconewton-Regime. DNA-Haarnadeln weisen einfache Zwei-Zustands-Übergänge in einem genau definierten Kraftbereich20,21 auf und dienen daher als Spielzeugmodelle, um die Leistung eines Pinzettenaufbaus zu überprüfen. Da sich die SNARE-Proteine zu einem kraftsensitiven Komplex zusammenfügen, der die Membranfusionantreibt 22, wurden sie auch ausgiebig mittels Einzelmolekül-Kraftspektroskopie untersucht 14,23,24,25. Es werden Standardansätze zur Analyse von Daten und zur Extraktion nützlicher Informationen über Thermodynamik und Kinetik vorgestellt. Wir hoffen, dass dieser Artikel die Einführung hochpräziser MTs in mechanobiologischen Studien erleichtern und die Leser motivieren kann, ihre eigenen kraftsensitiven Systeme zu erforschen.
In dieser Arbeit haben wir einen Einzelmolekül-Kraftspektroskopie-Aufbau vorgestellt, der strukturelle Veränderungen von Biomolekülen mit hoher raumzeitlicher Präzision beobachten kann. Die verwendete Hochgeschwindigkeits-CMOS-Kamera erfasst 1.200 Bilder s−1 bei einer Auflösung von 1.280 x 1.024 und ermöglicht so eine Perlenverfolgung von 1,2 kHz. Die Geschwindigkeit der Messungen ist jedoch derzeit durch die Bead-Tracking-Software begrenzt, so dass der ROI bei Hochgeschwindigkeitsmessungen in der Rege…
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss der National Research Foundation of Korea (NRF) unterstützt, der von der koreanischen Regierung (MSIT) finanziert wird (NRF-2022R1C1C1012176, NRF-2021R1A4A1031754 und NRF-2021R1A6A10042944). S.-H.R. wurde durch den NRF-Zuschuss (2021R1C1C2009717) unterstützt.
Materials for construct synthesis | |||
Agarose gel electrophoresis system | Advance | Mupid-2plus | |
DNA ladder | Bioneer | D-1037 | |
nTaq polymerase | Enzynomics | P050A | |
PCR purification kit | LaboPass | CMR0112 | |
PEGylated SMCC crosslinker / SM(PEG)2 | ThermoFisher Scientific | 22102 | For SNARE–DNA coupling |
Primer B | Bioneer | 5'-Biotin/TCGCCACCATCATTTCCA-3' | For 5-kbp force calibration construct and DNA handles |
Primer B_hp | IDT | 5'-Biotin/TTTTTTTTTTGTTCTCTATTT TTTTAGAGAAC /AP site/ /AP site/ TCGCCACCATCATTTCCA-3' |
For hairpin construct |
Primer N | Bioneer | 5'-C6Amine/CATGTGGGTGACGCGAAA-3' | For DNA handles |
Primer Z | Bioneer | 5'-Azide/TCGCCACCATCATTTCCA-3' | For DNA handles |
Primer Z_5k | Bioneer | 5'-Azide/TTAGAGAGTATGGGTATATGACA TCG-3' |
For 5-kbp force calibration construct |
Primer Z_hp | Bioneer | 5'-Azide/GTGGCAGCATGACACC-3' | For hairpin construct |
SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
λ-DNA | Bioneer | D-2510 | Template strand for PCR |
DNA sequences for SNARE proteins | |||
6×His-tagged SNAP-25b (2-206; capitalized) in pET28a | homemade | tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgca ttaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgca gcgtgaccgctacacttgccagcgccctagc gcccgctcctttcgctttcttcccttccttt ctcgccacgttcgccggctttccccgtcaag ctctaaatcgggggctccctttagggttccg atttagtgctttacggcacctcgaccccaaa aaacttgattagggtgatggttcacgtagtg ggccatcgccctgatagacggtttttcgccc tttgacgttggagtccacgttctttaatagt ggactcttgttccaaactggaacaacactca accctatctcggtctattcttttgatttata agggattttgccgatttcggcctattggtta aaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacg cgaattttaacaaaatattaacgtttacaat ttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgc ggaacccctatttgtttatttttctaaatac attcaaatatgtatccgctcatgaattaatt cttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaa ctgcaatttattcatatcaggattatcaata ccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatg aaggagaaaactcaccgaggcagttccatag gatggcaagatcctggtatcggtctgcgatt ccgactcgtccaacatcaatacaacctatta atttcccctcgtcaaaaataaggttatcaag tgagaaatcaccatgagtgacgactgaatcc ggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctt tccagacttgttcaacaggccagccattacg ctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaa 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6×His-tagged VAMP2 (2-97, L32C/I97C; capitalized) in pET28a | homemade | tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgca ttaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgca gcgtgaccgctacacttgccagcgccctagc gcccgctcctttcgctttcttcccttccttt ctcgccacgttcgccggctttccccgtcaag ctctaaatcgggggctccctttagggttccg atttagtgctttacggcacctcgaccccaaa aaacttgattagggtgatggttcacgtagtg ggccatcgccctgatagacggtttttcgccc tttgacgttggagtccacgttctttaatagt ggactcttgttccaaactggaacaacactca accctatctcggtctattcttttgatttata agggattttgccgatttcggcctattggtta aaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacg cgaattttaacaaaatattaacgtttacaat ttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgc ggaacccctatttgtttatttttctaaatac attcaaatatgtatccgctcatgaattaatt cttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaa ctgcaatttattcatatcaggattatcaata ccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatg aaggagaaaactcaccgaggcagttccatag gatggcaagatcctggtatcggtctgcgatt ccgactcgtccaacatcaatacaacctatta atttcccctcgtcaaaaataaggttatcaag tgagaaatcaccatgagtgacgactgaatcc ggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctt tccagacttgttcaacaggccagccattacg ctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaa 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|
6×His-tagged ΔN-VAMP2 (49–96; capitalized) and Syntaxin-1A (191–267, I202C/I266C; capitalized) in pETDuet-1 | homemade | ggggaattgtgagcggataacaattcccctc tagaaataattttgtttaactttaagaagga gatataccATGGGCAGCAGCCATCA TCATCATCATCACAGCAGCGG CCTGGAAGTTCTGTTCCAGGG GCCCGGTAATGTGGACAAGGT CCTGGAGCGAGACCAGAAGCT ATCGGAACTGGATGATCGCGC AGATGCCCTCCAGGCAGGGGC CTCCCAGTTTGAAACAAGTGC AGCCAAGCTCAAGCGCAAATAC TGGTGGAAAAACCTCAAGATGAT GTAAgcggccgcataatgcttaagtcgaaca gaaagtaatcgtattgtacacggccgcataa tcgaaattaatacgactcactataggggaat tgtgagcggataacaattccccatcttagta tattagttaagtataagaaggagatatacat ATGGCCCTCAGTGAGATCGAGA CCAGGCACAGTGAGTGCATC AAGTTGGAGAACAGCATCCG GGAGCTACACGATATGTTCAT GGACATGGCCATGCTGGTGG AGAGCCAGGGGGAGATGATT GACAGGATCGAGTACAATGTG GAACACGCTGTGGACTACGTG GAGAGGGCCGTGTCTGACACC AAGAAGGCCGTCAAGTACCAG AGCAAGGCACGCAGGAAGAA GTGCATGATCTAActcgagtc tggtaaagaaaccgctgctgcgaaatttgaa cgccagcacatggactcgtctactagcgcag cttaattaacctaggctgctgccaccgctga gcaataactagcataaccccttggggcctct aaacgggtcttgaggggttttttgctgaaag 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SNAP-25b (1–206, all C to A; capitalized) in pET28a | homemade | tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgca ttaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgca gcgtgaccgctacacttgccagcgccctagc gcccgctcctttcgctttcttcccttccttt ctcgccacgttcgccggctttccccgtcaag ctctaaatcgggggctccctttagggttccg atttagtgctttacggcacctcgaccccaaa aaacttgattagggtgatggttcacgtagtg ggccatcgccctgatagacggtttttcgccc tttgacgttggagtccacgttctttaatagt ggactcttgttccaaactggaacaacactca accctatctcggtctattcttttgatttata agggattttgccgatttcggcctattggtta aaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacg cgaattttaacaaaatattaacgtttacaat ttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgc ggaacccctatttgtttatttttctaaatac attcaaatatgtatccgctcatgaattaatt cttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaa ctgcaatttattcatatcaggattatcaata ccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatg aaggagaaaactcaccgaggcagttccatag gatggcaagatcctggtatcggtctgcgatt ccgactcgtccaacatcaatacaacctatta atttcccctcgtcaaaaataaggttatcaag tgagaaatcaccatgagtgacgactgaatcc ggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctt tccagacttgttcaacaggccagccattacg ctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaa 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Materials for protein purificaiton | |||
2-Mercaptoethanol | SIGMA | M3148-25ML | |
Agar | LPS Solution | AGA500 | |
Ampicillin, Sodium salt | PLS | AC1043-005-00 | |
Chloramphenicol | PLS | CR1023-050-00 | |
Competent cells (E. coli) | Novagen | 70956 | Rosetta(DE3)pLysS |
Glycerol | SIGMA | G5516-500ML | |
HEPES | SIGMA | H4034-100G | |
Hydrochloric acid / HCl | SIGMA | 320331-500ML | |
Imidazole | SIGMA | I2399-100G | |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside / IPTG | SIGMA | 10724815001 | |
Kanamycin Sulfate | PLS | KC1001-005-02 | |
Luria-Bertani (LB) Broth | LPS Solution | LB-05 | |
Ni-NTA resin | Qiagen | 30210 | |
PD MiniTrap G-25 (desalting column) | Cytiva | GE28-9180-07 | For instructions, see: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/chromatography/prepacked-columns/desalting-and-buffer-exchange/pd-minitrap-desalting-columns-with-sephadex-g-25-resin-p-06174 |
Phenylmethylsulfonyl fluoride / PMSF | ThermoFisher Scientific | 36978 | |
Plasmids for SNARE proteins | cloned in house | N/A | Available upon request |
Protease inhibitor cocktail | genDEPOT | P3100 | |
Sodium chloride | SIGMA | S5886-500G | |
Sodium phosphate dibasic / Na2HPO4 | SIGMA | S7907-100G | |
Sodium phosphate monobasic / NaH2PO4 | SIGMA | S3139-250G | |
Tris(2-carboxyethyl)phosphine / TCEP | SIGMA | C4706-2G | |
Trizma base | SIGMA | T1503-250G | |
Materials for sample assembly | |||
Biotin-PEG-SVA | LAYSAN BIO | BIO-PEG-SVA-5K-100MG & MPEG-SVA-5K-1g | For PEGylation |
Dibenzocyclooctyne-amine / DBCO-NH2 | SIGMA | 761540-10MG | For bead coating |
Double-sided tape | 3M | 136 | For flow cell assembly |
Epoxy glue | DEVCON | S-208 | For flow cell assembly |
Glass coverslip for bottom surface | VWR | 48393-251 | Rectangular, 60×24 mm, #1.5 |
Glass coverslip for top surface | VWR | 48393-241 | Rectangular, 50×24 mm, #1.5 |
Magnetic bead | ThermoFisher Scientific | 14301 | Dynabeads M-270 Epoxy, 2.8 μm |
mPEG-SVA | LAYSAN BIO | mPEG-SVA 1g | For PEGylation |
N,N-Dimethylformamide / DMF | SIGMA | D4551-250ML | For bead coating |
N-[3-(trimethoxysilyl)propyl]ethylenediamine | SIGMA | 104884-100ML | For PEGylation |
Neutravidin | ThermoFisher Scientific | 31000 | For sample tethering |
Phosphate buffered saline / PBS, pH 7.2 | PLS | PR2007-100-00 | |
Plastic syringe | Norm-ject | A5 | 5 ml, luer tip |
Polyethylene Tubing | SCI | BB31695-PE/4 | PE-60 |
Reference bead | SPHEROTECH | SVP-30-5 | Streptavidin-coated Polystyrene Particles; 3.0-3.4 µm |
Syringe needle | Kovax | 21G-1 1/4'' | 21 G |
Syringe pump | KD SCIENTIFIC | 788210 | |
Equipment for magnetic tweezer instrument | |||
1-axis motorized microtranslation stage | PI | M-126.PD1 | For vertical positioning of magnets |
2-axis manual translation stage | ST1 | LEE400 | For alignment of magnets to the optical axis |
Acrylic holder for magnets | DaiKwang Precision | custum order | Drawing available upon request |
Frame grabber | Active Silicon | AS-FBD-4XCXP6-2PE8 | |
High-speed CMOS camera | Mikrotron | EoSens 3CXP | |
Inverted microscope | Olympus | IX73P2F-1-2 | |
Neodymium magnets | LG magnet | ND 10x10x12t | Dimension: 10 mm × 10 mm × 12 mm; two needed |
Objective lens | Olympus | UPLXAPO100XO | Oil-immersion, NA 1.45 |
Objective lens nanopositioner | Mad City Labs | Nano-F100S | |
Rotation stepper motor | AUTONICS | A3K-S545W | For rotating magnets |
Superluminescent diode | QPHOTONICS | QSDM-680-2 | 680 nm |
Software | |||
LabVIEW | National Instruments | v20.0f1 | |
MATLAB | MathWorks | v2021a |