여기에 제시된 것은 장기 바이오뱅킹을 위한 원발성 기관지 상피 세포의 분리 및 확장과 공기-액체 계면에서 배양에 의한 분화된 상피 세포의 생성을 위한 재현 가능하고 저렴하며 강력한 방법입니다.
기도 상피 세포층은 폐 조직과 외부 환경 사이의 첫 번째 장벽을 형성하여 감염원 및 대기 오염 물질을 포함한 흡입 물질에 지속적으로 노출됩니다. 기도 상피층은 매우 다양한 급성 및 만성 폐 질환에서 중심적인 역할을 하며, 이 상피를 표적으로 하는 다양한 치료법이 흡입에 의해 투여됩니다. 병인에서 상피의 역할과 상피가 치료를 위해 표적이 될 수 있는 방법을 이해하려면 강력하고 대표적인 모델이 필요합니다. 체외 상피 배양 모델이 점점 더 많이 사용되고 있으며 통제된 환경에서 실험을 수행하여 세포를 다양한 종류의 자극, 독성 물질 또는 감염원에 노출시키는 이점을 제공합니다. 불멸화 또는 종양 세포주 대신에 일차 세포를 사용하는 것은 이들 세포가 세포주에 비해 상피의 더 나은 표현을 갖는 가성층화된 분극 상피 세포층으로 배양에서 분화된다는 이점을 갖는다.
여기에 제시된 것은 폐 조직에서 기도 상피 세포의 분리 및 배양을 위해 지난 수십 년 동안 최적화된 강력한 프로토콜입니다. 이 절차는 공기-액체 계면(ALI)에서 배양하여 원발성 기관지 상피 세포(PBEC)의 성공적인 분리, 확장, 배양 및 점막섬모 분화를 가능하게 하며 바이오뱅킹을 위한 프로토콜을 포함합니다. 또한, 세포 특이적 마커 유전자를 사용한 이러한 배양물의 특성화가 설명됩니다. 이러한 ALI-PBEC 배양은 전체 담배 연기 또는 염증 매개체에 대한 노출, 바이러스 또는 박테리아와의 공동 배양/감염을 포함한 다양한 응용 분야에 사용할 수 있습니다.
절차를 단계별로 설명하는 이 원고에 제공된 프로토콜은 실험실에서 이러한 배양 시스템을 구현하거나 적용하는 데 관심이 있는 사람들에게 기초 및/또는 참고 자료를 제공할 것으로 기대됩니다.
다양한 급성 및 만성 폐 질환에서 기도 상피의 역할은 다양한 문헌고찰 1,2,3,4,5,6,7에 기재되어 있다. 기도 상피 세포의 잘 분화된 배양은 기도 상피의 역할을 밝히는 중요한 도구입니다. 공기-액체 계면(ALI) 기도 상피 세포 배양은 기도 기저 상피 세포의 분화를 촉진하고 이를 통해 시험관 내에서 기도 상피를 안정적으로 연구하기 위해 광범위하게 적용됩니다 8,9. 지난 몇 년 동안 COVID-19 대유행과 관련된 새로운 연구 이니셔티브와 전 세계적으로 동물 없는 연구로의 전환의 결과로 이러한 모델의 사용이 더욱 증가했습니다. 따라서 이 모델 세포주의 사용 증가는 강력한 결과를 얻기 위해 절차와 경험을 공유해야 할 필요성을 강조합니다. 이것은 또한 연구 그룹 간의 결과 비교를 가능하게 할 것입니다. 절차의 견고성은 핵심 특성이므로 품질 관리를 받아야 합니다. 여러 실험실에서 ALI에서 일차기도 상피 세포를 배양하기 위한 프로토콜 개발에 투자했습니다. 이러한 절차를 자세히 공유하면 시간, 노력 및 필요한 예산을 줄일 수 있습니다. 이러한 세부사항은, 예를 들어, 다양한 제조업자에 의해 제공된 세포 배양 플라스틱 및 배지의 선택을 포함하는데, 이는 이것이 얻어진 배양물의 특성에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌기 때문이다10,11,12. 이는 배양 절차의 경험과 세부 사항을 공유하는 것의 중요성을 강조하는데, 그러한 통찰력이 없으면 결과에 영향을 미치거나 다양한 실험실에서 검증 노력이 방해를 받을 수 있기 때문입니다.
인간 폐 상피는 기저 세포, 섬모 세포, 배 세포 및 클럽 세포와 같은 주요 유형을 포함하여 다양한 세포 유형을 포함합니다. 시험관 내 기도에서 상피 세포층을 신뢰성 있게 모방하기 위해서는 이러한 세포 유형이 배양 모델에서 표현되어야 하며 이들의 분극과 기능이 유지되어야 합니다13,14,15,16. 기증자 특성(질병 상태 포함)과 세포의 해부학적 기원(즉, 비강, 기관, 대기도 및 소기도)이 세포 배양의 세포 구성 및 기능적 반응에 영향을 미칠 수 있다는 인식은 똑같이 중요합니다. 관련 전문 지식과 실습은 일차성 기도 상피 세포를 성공적으로 배양하고 직관적으로(배양 중 육안 검사에 의해) 배양 품질을 정량적으로 평가하기 위한 전제 조건입니다. 이 기여의 목적은 기관 및 소기도 상피 세포의 배양에도 적용할 수 있는 일차 인간 기관지 상피 세포(PBEC)의 분리 및 배양을 위한 비용 및 시간 효율적인 방법을 제공하는 것입니다. 절제된 폐 조직에서 이러한 세포를 분리하는 방법을 설명하는 것 외에도 확장 및 바이오뱅킹 방법, 그리고 마지막으로 합리적인 비용과 기간 내에 잘 분화된 ALI 배양의 확립 및 특성화를 위한 방법을 제시하고 논의합니다.
여기에 제시된 프로토콜은 절제된 폐 조직에서 인간 기관지 상피 세포의 분리, 분화 잠재력의 손실 없이 세포의 최적 확장을 위한 방법, 냉동 보존 절차 및 잘 분화된 ALI-PBEC 배양을 생성하는 절차를 설명합니다. 또한 품질 관리에 대한 설명과 차별화된 ALI-PBEC의 모니터링 및 평가 지침이 제공됩니다.
설명된 프로토콜은 폐암 진단과 관련된 수술을 받는 환자의 폐엽에서 절제된 거시적으로 정상적이고 종양이 없는 기관지 링으로 시작합니다. 따라서 이러한 고리는 엄격하게 건강한 조직으로 간주될 수 없으므로 세포 배양 특성에 영향을 미칠 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 기관지 상피 세포를 얻기 위한 대안적인 공급원은 기관지 생검, 기관지 칫솔질, 또는 이식 기증자 또는 수용자 폐로부터의 조직을 사용하는 것을 포함한다. 출처에 관계없이 폐 조직을 사용할 때 미생물 오염 위험을 고려해야하므로 세포 배양의 미생물 오염 위험을 줄이기 위해 다른 배양 배지에서 항생제를 사용합니다. 특히, 마이코플라스마는 세포 배양에 미치는 다양한 영향, 세포 배양에 일반적으로 사용되는 항생제에 대한 내성, 마이코플라스마 오염은 마이코플라스마 검출 분석에 의해서만 확인할 수 있기 때문에 세포 배양에서 높고 흔한 위험입니다. 따라서 폐 조직에서 세포를 분리 한 후 세포 배양의 초기 단계에서 광범위한 항균 제제 인 Primocin을 사용하고 배양 과정에서 무작위로 선택된 샘플을 마이코 플라스마의 존재 여부를 테스트합니다.
기관지 고리로 시작하는 분리 절차는 분화 능력을 손상시키지 않으면서 ALI에서 배양을 시작하는 데 필요한 이러한 일차 세포의 확장 정도를 허용하기에 충분한 출발 물질을 제공합니다. 그러나, 제한된 수의 세포로 분리된 상피 세포의 확장을 시작하면 ALI 배양을 위해 시딩될 수 있는 충분한 수의 세포와 함께 충분한 수의 삽입물을 얻는 데 문제가 발생할 수 있습니다. 일차 세포의 연장된 배양 및 반복적인 계대배양은 복제 노화를 초래할 수 있습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 다양한 해결책이 제안되었습니다. Horani 등은 Rho 키나제 억제제(ROCK) Y-27632가 기저 세포의 증식을 증가시킨다는 것을 보여주었고30, Mou 등은 분화된 상피 세포층(31)의 특성을 유지하면서 기저 줄기 세포를 확장하기 위해 이중 Smad 억제를 사용했으며, Sachs 등은 기도 상피 세포를 확장하고 여러 계대 동안 분화 가능성을 유지하는 데 사용할 수 있는 기도 오가노이드 시스템을 개발했습니다32. 후자의 방법은 또한 여기에 설명된 바와 같이 ALI 배양으로 옮기기 전에 조산아(임신 28주령)의 기관 흡인물<(TA) 및 기관지폐포 세척액(BAL)과 같이 세포 수가 매우 낮은 공급원에서 세포를 확장하는 데 사용되었습니다(33). 기관지 폐 화합물 및 TA로부터 분리된 세포는 기관지 조직에서 생성된 세포와 유사한 분화 능력을 보였지만, Notch 신호 전달 억제 또는 Th2 사이토카인 IL-13을 사용하여 분화가 더 섬모 또는 더 많은 잔 함유 배양으로 편향되었을 때 차이가 관찰되었다33. 따라서 유사한 접근법을 사용하여 상피 세포 수가 낮은 출발 물질에서 ALI-PBEC를 배양하는 경우 프로토콜의 섹션 6에서 논의된 대로 항상 기본 품질 기준에 대한 배양을 확인하는 것이 좋습니다. 중요하게도, 영양 세포의 사용은 또한 더 큰 세포 수를 얻는 데 도움이 될 수 있으며, 이는 시간과 세포 수가 필수적인 이식 가능한 스캐폴드 엔지니어링 환경에서 필수적입니다. 이것은 기관 질환 환자로부터 유래한 생검에서 자가 상피 세포를 배양하고 쥐 배아 영양층(유사분열적으로 비활성화된 3T3-J2 섬유아세포)과 위에서 언급한 Rho/ROCK 경로의 억제제(Y-27632)34. 생성된 세포 배양은 기관 스캐폴드의 재증식에 유용한 것으로 밝혀졌으며, 따라서 이것은 이식 모델에 적합한 프로토콜로 볼 수 있습니다.
이 기여에 설명된 프로토콜을 사용할 때뿐만 아니라 다른 배양 프로토콜을 사용할 때도 필연적으로 선택 편향이 도입됩니다. 배양을 개시하는 데 사용되는 세포의 기원, 배지 조성 및 기타 프로토콜 세부사항과 같은 프로토콜 세부사항의 차이는 배양의 세포 구성의 변화로 이어질 수 있으며, 이에 따라 ALI 배양의 반응이 변화할 수 있다는 것을 인식하는 것이 중요하다33,35. 또한, 기도 세포를 분화시키기 위한 상이한 배지를 비교할 때 세포 특성의 차이가 또한 관찰되었다10,11. PneumaCult와 cBD 배지를 비교했을 때, 배상 세포와 클럽 세포 mRNA 마커, TEER 값 및 세포층 두께에서 차이가 관찰되었습니다. 이러한 관찰을 바탕으로 통계적 토대가 부족함에도 불구하고 사용된 기증자 수가 적고 배지 구성이 고객에게 알려지지 않았으며 PneumaCult 배지의 비용이 높기 때문에 우리 실험실에서 cBD 배지를 사용하기로 결정했습니다.
앞서 살펴본 바와 같이, 세포는 오가노이드 배양을 사용하여 초기에 확장될 수 있으며, 이후 2D ALI 삽입 시스템으로 옮겨질 수 있습니다. 기도 상피 오가노이드는 공기 중 물질에 노출되기에 적합하지 않은 반면, ALI 2D 시스템을 사용하면 담배 연기23,36과 같은 공기 중 물질이 배양된 기도 상피 세포에 미치는 영향을 평가할 수 있기 때문에 이는 중요합니다. ALI 기도 상피 세포 배양을 확립하기 위한 다른 접근 방식은 인간 만능 줄기 세포(hiPSC)의 분화에 의해 기도 상피 세포를 생성하는 것입니다37. 이러한 프로토콜에서, 근위 기도 전구체로 분화한 후 분화 프로토콜의 최종 단계에서, 세포는 여기에 기술된 것과 유사한 절차를 사용하여 ALI로의 배양에 의해 분화될 수 있다.
현재 프로토콜에서 cBD 배지는 ALI에서 배양에 사용됩니다. cBD 배지는 Fulcher et al.38 및 기타 연구에서 영감을 받은 다양한 보충제를 혼합하여 제조한 무혈청 배지입니다. 보충 용액에는 52μg/mL 소 뇌하수체 추출물(BPE), 0.5μg/mL 하이드로코르티손, 0.5ng/mL 인간 EGF, 0.5μg/mL 에피네프린, 10μg/mL 트랜스페린, 5μg/mL 인슐린, 6.5ng/mL 트리요오드티로닌 및 0.1ng/mL RA39가 포함되어 있습니다. BPE는 조직 추출물이고 배치별 변형을 거치기 때문에 배지는 완전히 정의된 배지로 간주될 수 없으며 동물이 없는 것도 아닙니다. 완전히 규정되어 있는 세포 배양 배지는 배치 간 차이를 최소화하는 것이 바람직하다. 동물성 없는 연구로의 전환을 고려할 때, 동물성 제품을 포함하지 않고 과학계에 적합한 정의된 배지를 생산하기 위한 노력이 중요합니다.
연구 질문에 따라 ALI 모델을 기반으로 다양한 실험 설정을 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 분화 과정에 영향을 미칠 수 있는 화합물의 영향을 조사하기 위해 수중 배양의 여러 단계, 분화 중 또는 잘 분화된 단계에서 배양에 화합물을 추가하여 이 문제를 해결할 수 있습니다. ALI-PBEC 배양의 세포 조성은 특정 화합물을 첨가함으로써 영향을 받을 수 있습니다. 예를 들어, IL-13의 존재 하에서 ALI-PBEC를 분화하면 더 많은 배상 세포와 더 적은 섬모 세포로 배양되는 반면, 분화 동안 γ-세크레타제 억제제 DAPT(Notch 신호 전달을 차단하는 데 사용됨)로 처리하면 배 세포를 희생시키면서 더 많은 섬모 세포로 배양됩니다(23,40,41,42).
또한, 세포를 자극하거나 특정 과정을 차단하는 제제는 기저 구획에 또는 (매우 작은 부피로) 배양의 정점 구획에 적용될 수 있습니다. 세포는 또한 정점 쪽에서 공기 중 물질에 노출될 수 있습니다. 이러한 노출 설계는 PBEC 23,43,44에 대한 디젤 배기 가스 또는 전체 담배 연기의 영향을 연구하는 데 사용되었습니다. 배지는 기저부에서 분비된 단백질을 모니터링하기 위해 배지가 변경될 때마다 수확할 수 있습니다. 기저 배지를 상쾌하게 하는 동안 PBS로 세척되는 세포의 정점 측면에도 동일하게 적용됩니다. 소위 정점 세척을 수확하고 선택적 디티오에리트리톨(DTE)을 첨가하여 배 세포에서 생성되는 점액을 보다 효율적으로 해리합니다. 세포 용해물은 총 단백질, RNA, 염색체 및 미토콘드리아 DNA의 분리를 위해 얻을 수 있습니다. 플라스틱 삽입물로부터 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (PET) 막을 절단하고 다중 면역형광 염색을 위해 이 막을 더 작은 조각으로 추가로 절단함으로써 특정 마커에 대한 항체를 사용하여 세포를 추가로 연구할 수 있다45. 또한, 유세포 분석 또는 FACS는 삽입물에서 세포의 트립신 처리 후에 사용될 수도 있습니다. ALI 단계에서 전기 저항을 측정하고 이후에 TEER을 계산하여 세포 장벽의 발달을 모니터링할 수 있으며, 여기서 전기 저항은 멤브레인 삽입물의 표면적에 반비례합니다. 계산은 다음 공식을 사용하는 옴의 법칙을 기반으로 합니다: 여기서 Rm은 측정된 전기 저항이고, Rb는 코팅 및 셀이 없는 삽입물의 기준선 전기 저항이고, SA는 삽입물의 멤브레인의 표면적입니다. EVOM2 및 STX/젓가락 전극을 사용하여 전기 저항을 측정하는 것은 간단하지만 웰에 도입할 때 취급 절차에 크게 의존합니다. 또한, 전극의 형상은 상대적으로 넓은 표면적(17)의 배리어 기능의 측정에 영향을 미치는 것으로 제안되었다.
정확한 조직 표현을 증가시키는 것을 목표로 하는 ALI 세포 배양 시스템의 추가 개선에는 백혈구, 섬유아세포 또는 내피 세포와 같은 추가 세포 유형의 공동 배양이 포함됩니다46,47,48. ALI-PBEC와 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF) 또는 M-CSF 분화 대식세포의 공동 배양이 선천성 상피 반응 및 복구에 현저한 영향을 미치는 것으로 관찰되었습니다48. 이러한 공동 배양 모델에서는 배지 호환성이 문제가 될 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 기도 상피 세포 배양에 사용되는 배지는 PBEC용으로 특별히 개발되었으며 다른 세포 유형에는 최적으로 적합하지 않을 수 있으므로 최적화가 필요합니다. 분리된 PBEC가 사용될 수 있는 기도 생물학 분야에서 볼 수 있는 또 다른 유형의 발전은 OoC(Organs-on-Chips) 기술49,50의 사용이다. 이 기술을 사용하여 스트레칭, 공기 및 중간 흐름과 같은 호흡 및 혈류의 기계적 힘의 영향을 연구 할 수 있습니다 29.
다양한 기증자의 PBEC를 사용할 때 기증자 간 가변성은 중요할 수 있으므로 상피 세포 배양 연구에서 이러한 가변성을 설명하기 위해 여러 기증자의 세포를 사용하는 것을 고려하는 것이 중요합니다. ALI-PBEC의 배양은 시간이 많이 걸리고 상당한 비용이 들기 때문에 하나의 세포 배양 삽입물에서 서로 다른 기증자의 세포를 혼합하여 ALI-PBEC 배양을 확립하는 옵션을 검토합니다. 이러한 방식으로 파일럿 실험은 다양한 개별 기증자로부터 파생된 배양물의 반응을 분석하기 전에 일차 세포를 사용하여 쉽게 수행할 수 있습니다. 또한 탐색적 연구를 위해 다양한 특성(예: 연령 범주 또는 성별)을 가진 기증자를 그룹화할 수 있습니다. 기증자 혼합물을 사용할 때 더 높은 증식률로 인해 한 기증자가 결과를 지배할 가능성을 방지하기 위해 서로 다른 기증자의 동일한 세포 수가 존재하는지 확인하는 것이 중요합니다. 따라서 개별 공여자의 세포는 개별적으로 확장되고 개별 기증자의 파종 세포에 비해 삽입물에서 더 높은 밀도로 시딩되어 ALI로 전환되기 전에 삽입물에서 증식을 최소화합니다. SARS-CoV-2의 감염 동역학을 연구하여 기증자 믹스와 해당 개별 기증자의 반응을 비교했습니다. RT-qPCR 및 면역형광 염색을 사용하여, 생성된 유사한 수의 바이러스 입자와 유사한 수의 감염된 세포를 보여줌으로써 공여체 혼합물이 다양한 개별 기증자를 잘 나타내는 것으로 관찰되었다28.
동물 모델에 대한 수용 가능한 대안이 되려면 배양된 기관지 상피 세포의 유전자 편집이 가능해야 합니다51. 그러나 ALI-PBEC에서 작은 간섭 RNA(siRNA)를 사용하는 RNA 간섭 기술이 검토되지만, 배양의 잠수 단계에서 세포가 siRNA로 형질감염되어야 하기 때문에 배양 중에 siRNA 형질감염이 자주 반복되지 않는 한 배양 기간이 길기 때문에 ALI 배양 중에 녹다운이 충분히 유지되지 않습니다52. 그럼에도 불구하고, siRNA는 물에 잠긴 기저 세포에서 유전자 발현을 변형시키는 데 성공적으로 사용될 수 있습니다. 다른 연구자들은 CRISPR/Cas9 기술을 성공적으로 사용하여 리보핵단백질(ribonucleoprotein, RNP) 전달을 통한 1차 ALI 기도 상피 세포 배양에서 유전자 편집을 달성했다 53. 이러한 기술을 사용할 때 세포가 완전한 분화 능력을 유지하는 것이 필수적입니다. 1차 기도 세포 배양은 무한정 계대배양할 수 없기 때문에 유전자 편집 세포의 클론 확장이 쉽지 않고 형질주입된 세포를 선택하기 위한 배지 추가가 번거롭다. 따라서, 모든 배양된 세포에서 바람직한 녹다운을 달성하는 것은 어렵다. 녹아웃 클론을 생성하는 대안은hiPSCs(54 )에서 녹아웃 전략을 사용하고 이들 세포를 사용하여 기도 상피 세포를 생성하는 것이다. 차선책이기는 하지만 또 다른 대안은 유전자 편집 세포를 클론적으로 확장하기 위해 불멸화된 PBEC 라인을 구축하는것입니다(55).
여기에 제시된 프로토콜은 잘 차별화된 pseudostratified ALI-PBEC를 생성하는 한 가지 방법이지만, 제시된 프로토콜에 비해 점점 더 큰 차이로 이러한 문화를 확립하는 다른 프로토콜도 발견되었습니다. 실험실 전반에 걸쳐 배양 방법에 대한 검증과 엄격한 품질 관리가 ALI-PBEC 시스템 및 기도 상피 세포의 유사한 배양 시스템이 동물 실험의 유효한 대안이 되기 위해서는 필수적입니다.
The authors have nothing to disclose.
이 기여에 설명된 모델을 사용한 연구는 Lung Foundation Netherlands, 네덜란드 보건 연구 개발 기구(ZonMw, COVID-19 MKMD 보조금), 네덜란드 동물 실험 대체 협회(Stichting Proefdiervrij, 보조금 #114025007), Boehringer Ingelheim 및 Galapagos와 같은 회사의 연구 보조금을 포함한 다양한 자금 지원 기관의 지원을 받았습니다. 그림 1 은 BioRender.com 사용하여 작성되었습니다.
1,000 ohm test resistor | World Precision Instruments | N/A | Used to calibrate the EVOM2 Epithelial Voltohmmeter |
4-[2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)ethynyl)-benzoic acid (EC 23) | Tocris | 4011 | Used in cBD medium |
6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning | 3506 | Used in the first step to grow the cells isolated form the bronchial ring |
Airway Epithelial Cell Growth Medium Kit | PromoCell | C-21160 | Used to compare to cBD medium |
Bead Bath 20 Liter | Lab Armor | 74220-720 | Used to pre-warm cell culture solutions |
BEGM Bronchial Epithelial Cell Growth Medium BulletKit | LONZA | CC-3170 | Used to compare to cBD medium |
Bovine albumin fraction V (BSA) | Thermo Fisher Scientific | 15260037 | Used in coating solution |
Bovine pituitary extract (BPE) | Thermo Fisher Scientific | 37000-015 | Used in c-KSFM |
Bronchial epithelial cell growth supplement (BEpiCGS) | ScienCell Research Laboratories | 3262 | Used in cBD medium |
Bronchial epithelial cell medium-basal (BEpiCM-b) | ScienCell Research Laboratories | SCC3211-b | Used in cBD medium |
Cell culture inserts; 12 mm Transwell with 0.4 µm pore polyester membrane insert | Corning | 3460 | Cell culture inserts used in the protocol |
Cell culture inserts; 12-well inserts, 0.4 µm PET clear | CellQART made by SABEU | 9310412 | Cell culture inserts used to compare with Corning cell culture inserts |
Cell culture inserts; 12-well ThinCert Tissue culture Inserts | Greiner Bio-One | 82050-032 | Cell culture inserts used to compare with Corning cell culture inserts |
CELLSTAR flask, TC, PS, 250 ml, 75 cm2 | Greiner Bio-One | 658170 | Used to expand the number cells |
CFX Maestro 1.0 | Bio-Rad | N/A | Software program for analyzing qPCR data generated with the CFX384 System |
CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855484 | qPCR detection system |
Chopstick electrode set | World Precision Instruments | STX2 | Used to measure electrical resistance in ALI-PBEC |
CO2-Incubator | PHCbi | MCO-170AICUV-PE | Cell culture incubator used for mycplasma free cell cultures |
CO2-Incubator | Hereaus | Heracell 150 | Cell culture incubator used for possibly mycplasma infected cell cultures |
Coolcell Container | Corning | 432006 | Used to cryopreserve cells at -80 °C before transfer to liquid N2 |
Countess 3 Automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX2000 | Used to count cells and determine the cell concentration |
Cryovials | Nalgene | 479-3224 | Used to cryopreserve cells in |
D-Glucose | Avantor VWR BDH CHEMICALS | 101174Y | Used in soft trypsin |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Avantor VWR | 0231 | Used in cell freeze medium |
dNTP (10 mM) | Promega | U1515 | Used in the synthesis of cDNA |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) + 4500 mg/l D-Glucose | STEMCELL Technologies | 36250 | Used in cBD medium |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 4.5 g/l glucose with l-glutamine | LONZA | LOBE12-604F | Used in cBD medium to compare with DMEM from other manufacturers |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 41966029 | Used in cBD medium to compare with DMEM from other manufacturers |
Epidermal growth factor (EGF) | Thermo Fisher Scientific | 37000-015 | Used in c-KSFM |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Avantor VWR BDH CHEMICALS | 443885J | Used in soft trypsin |
EVOM2 Epithelial Voltohmmeter | World Precision Instruments | 91799 | Used with the chopstick electrode set to measure electrical resistance in ALI-PBEC |
Fibronectin solution, Human | PromoCell | C-43060 | Used in coating solution |
Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | Used in cBD medium |
Hanks balanced salt solution (HBSS) | ScienCell Research Laboratories | SCC0313 | Used to dissolve protease XIV |
IQ SYBR Green Super mix | Bio-Rad | 170887 | qPCR reagent |
Isoproterenol hydrochloride, (-)- | Sigma-Aldrich | I-6504 | Used in c-KSFM |
Keratinocyte-SFM (KSFM) | Thermo Fisher Scientific | 17005-034 | Used in c-KSFM |
Maxwell RSC Instrument | Promega | AS4500 | Automated RNA isolation system |
Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit | Promega | AS1340 | Used to isolate total RNA with the Maxwell RSC Instrument |
M-MLV Reverse transcriptase | Promega | M5301 | Used in the synthesis of cDNA |
M-MLV Reverse transcriptase 5X reaction buffer | Promega | M531A | Used in the synthesis of cDNA |
MycoStrip | InvivoGen | rep-mys-10 | Used to detect the presence of mycoplasma in cell culture samples |
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) | Thermo Fisher Scientific | 15630056 | Used in cBD medium |
Oligo(dT)15 | Qiagen | 79237 | Used in the synthesis of cDNA |
Penicillin/Streptomycin solution (Pen/Strep) | ScienCell Research Laboratories | SCC0513 | Used as antibiotic in c-KSFM and cBD medium |
Phosphate buffered saline (PBS) | LUMC pharmacy | N/A | Used in different steps of the protocol |
Pneumacult-ALI Medium | STEMCELL Technologies | 05002 | Used to grow cells in the differentiation stage to compare to cBD medium |
Pneumacult-Ex Plus Medium | STEMCELL Technologies | 05040 | Used to grow cells in the submerged stage to compare to cBD medium |
Primer, ATP5B, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: TCACCCAGGCTGGTTCAGA |
Primer, ATP5B, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: AGTGGCCAGGGTAGGCTGAT |
Primer, FOXJ1, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: GGAGGGGACGTAAATCCCTA |
Primer, FOXJ1, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: TTGGTCCCAGTAGTTCCAGC |
Primer, MUC5AC, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: CCTTCGACGGACAGAGCTAC |
Primer, MUC5AC, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: TCTCGGTGACAACACGAAAG |
Primer, MUC5B, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: GGGCTTTGACAAGAGAGT |
Primer, MUC5B, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: AGGATGGTCGTGTTGATGCG |
Primer, RPL13A, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: AAGGTGGTGGTCGTACGCTGTG |
Primer, RPL13A, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: CGGGAAGGGTTGGTGTTCATCC |
Primer, SCGB1A1, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: ACATGAGGGAGGCAGGGGCTC |
Primer, SCGB1A1, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: ACTCAAAGCATGGCAGCGGCA |
Primer, TP63, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: CCACCTGGACGTATTCCACTG |
Primer, TP63, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: TCGAATCAAATGACTAGGAGGGG |
Primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | Used as antimicrobial agent against bacteria, mycoplasma, and fungi in c-KSFM medium |
Protease XIV | Sigma-Aldrich | P5147 | Used for the enzymatic treatment of the bronchial ring |
RNAsin Recombinant Ribonuclease inhibitor | Promega | N2515 | Used in the synthesis of cDNA |
Soybean trypsin inhibitor (SBTI) | Sigma-Aldrich | T9128 | Used to inhibit the action of soft trypsin |
T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | Used in the synthesis of cDNA |
TissueSAFE plus | MILESTONE MEDICAL | N/A | Vacuum transfer system for biological specimens |
Trypan blue solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Used to count live- and dead cells |
Trypsin 1:250 | Thermo Fisher Scientific | 27250-018 | Used in soft trypsin |
Type I collagen solution (PureCol) | Advanced BioMatrix | 5005-B | Used in coating solution |
Universal container, PP, with PE screw cap | Avantor VWR | 216-2053 | Used in the protocol for the Protease XIV treatment of the bronchial ring |