Hier wordt een reproduceerbare, betaalbare en robuuste methode gepresenteerd voor de isolatie en uitbreiding van primaire bronchiale epitheelcellen voor biobanking op lange termijn en het genereren van gedifferentieerde epitheelcellen door cultuur op de lucht-vloeistofinterface.
De luchtwegepitheelcellaag vormt de eerste barrière tussen longweefsel en de buitenomgeving en wordt daardoor voortdurend blootgesteld aan ingeademde stoffen, waaronder infectieuze agentia en luchtverontreinigende stoffen. De luchtwegepitheellaag speelt een centrale rol bij een grote verscheidenheid aan acute en chronische longziekten en verschillende behandelingen gericht op dit epitheel worden toegediend door inademing. Het begrijpen van de rol van epitheel in pathogenese en hoe het kan worden gericht voor therapie vereist robuuste en representatieve modellen. In vitro epitheliale cultuurmodellen worden steeds vaker gebruikt en bieden het voordeel van het uitvoeren van experimenten in een gecontroleerde omgeving, waarbij de cellen worden blootgesteld aan verschillende soorten stimuli, toxische stoffen of infectieuze agentia. Het gebruik van primaire cellen in plaats van vereeuwigde of tumorcellijnen heeft als voordeel dat deze cellen in cultuur differentiëren tot een pseudogestratificeerde gepolariseerde epitheelcellaag met een betere weergave van het epitheel in vergelijking met cellijnen.
Hier wordt een robuust protocol gepresenteerd, dat de afgelopen decennia is geoptimaliseerd, voor de isolatie en kweek van luchtwegepitheelcellen uit longweefsel. Deze procedure maakt succesvolle isolatie, expansie, cultuur en mucociliaire differentiatie van primaire bronchiale epitheelcellen (PBECs) mogelijk door te kweken op de lucht-vloeistofinterface (ALI) en omvat een protocol voor biobanking. Verder wordt de karakterisering van deze culturen met behulp van celspecifieke markergenen beschreven. Deze ALI-PBEC-culturen kunnen worden gebruikt voor een reeks toepassingen, waaronder blootstelling aan hele sigarettenrook of ontstekingsmediatoren, en co-cultuur / infectie met virussen of bacteriën.
Het protocol in dit manuscript, dat de procedure stapsgewijs illustreert, zal naar verwachting een basis en / of referentie bieden voor diegenen die geïnteresseerd zijn in het implementeren of aanpassen van dergelijke kweeksystemen in hun laboratorium.
De rol van het luchtwegepitheel bij een verscheidenheid aan acute en chronische longziekten is beschreven in verschillende beoordelingen 1,2,3,4,5,6,7. Goed gedifferentieerde culturen van luchtwegepitheelcellen zijn een belangrijk hulpmiddel om de rol van het luchtwegepitheel te ontrafelen. Air-liquid interface (ALI) luchtwegepitheelcelcultuur wordt breed toegepast om de differentiatie van basale epitheelcellen van de luchtwegen te bevorderen en daardoor het luchtwegepitheel betrouwbaar in vitro 8,9 te bestuderen. In de afgelopen jaren is het gebruik van dergelijke modellen nog verder toegenomen als gevolg van nieuwe onderzoeksinitiatieven met betrekking tot de COVID-19-pandemie en een wereldwijde overgang naar proefdiervrij onderzoek. Daarom benadrukt het toegenomen gebruik van deze modelcellijn de noodzaak van het delen van procedures en ervaringen om robuuste resultaten te verkrijgen. Dit zal ook de vergelijking van resultaten tussen onderzoeksgroepen mogelijk maken. De robuustheid van de procedure is het belangrijkste kenmerk en moet daarom worden onderworpen aan kwaliteitscontrole. Verschillende laboratoria hebben geïnvesteerd in het ontwikkelen van protocollen voor het kweken van primaire luchtwegepitheelcellen bij de ALI. De tijd, moeite en het vereiste budget kunnen worden verminderd wanneer deze procedures in detail worden gedeeld. Deze details omvatten bijvoorbeeld de keuze van celkweekplastics en media die door verschillende fabrikanten worden verstrekt, aangezien dit de kenmerken van de verkregen culturen bleek te beïnvloeden10,11,12. Dit benadrukt het belang van het delen van ervaringen en details van cultuurprocedures, omdat bij gebrek aan dergelijke inzichten de resultaten kunnen worden beïnvloed en / of validatie-inspanningen in verschillende laboratoria kunnen worden belemmerd.
Het menselijke longepitheel bestaat uit verschillende celtypen, waaronder belangrijke typen zoals basale cellen, trilhaarcellen, bokaalcellen en clubcellen. Om de epitheelcellaag in de luchtwegen in vitro betrouwbaar na te bootsen, moeten deze celtypen in de kweekmodellen worden weergegeven en hun polarisatie en functie 13,14,15,16 behouden. Het besef dat donorkenmerken (inclusief ziektetoestand) en de anatomische oorsprong van de cellen (d.w.z. nasaal, tracheaal, grote en kleine luchtwegen) de cellulaire samenstelling en functionele reacties van de celcultuur kunnen beïnvloeden, is even belangrijk. Relevante expertise en praktijk zijn een voorwaarde om primaire luchtwegepitheelcellen met succes te kweken en de kwaliteit van de cultuur zowel intuïtief (door visuele inspectie tijdens de kweek) als kwantificeerbaar te beoordelen. Het doel van deze bijdrage is om een kosten- en tijdbesparende methode te bieden voor de isolatie en kweek van primaire menselijke bronchiale epitheelcellen (PBEC’s) die ook kan worden toegepast op de kweek van tracheale en kleine luchtwegepitheelcellen. Naast het beschrijven van een methode voor het isoleren van dergelijke cellen uit gereseceerd longweefsel, wordt een methode voor expansie en biobanking, en ten slotte voor de oprichting en karakterisering van een goed gedifferentieerde ALI-cultuur binnen een redelijke kosten en tijdsperiode gepresenteerd en besproken.
Het hier gepresenteerde protocol beschrijft de isolatie van menselijke bronchiale epitheelcellen uit gereseceerd longweefsel, een methode voor de optimale expansie van cellen zonder verlies van differentiatiepotentiaal, een cryopreservatieprocedure en een procedure voor het genereren van goed gedifferentieerde ALI-PBEC-culturen. Verder wordt een beschrijving van de kwaliteitscontrole gegeven, evenals instructies voor monitoring en evaluatie van de gedifferentieerde ALI-PBECs.
Het beschreven protocol begint met een macroscopisch normale, tumorvrije bronchiale ring die wordt gereseceerd uit een longkwab van patiënten die een operatie ondergaan in verband met hun longkankerdiagnose. Daarom moet worden opgemerkt dat deze ringen strikt genomen niet als gezond weefsel kunnen worden beschouwd, wat derhalve de kenmerken van de celkweek kan beïnvloeden. Alternatieve bronnen voor het verkrijgen van bronchiale epitheelcellen zijn het gebruik van bronchiale biopsieën, bronchiale borstels of weefsel van een transplantatiedonor of ontvangende longen. Ongeacht de bron moet bij het gebruik van longweefsel rekening worden gehouden met een risico op microbiële besmetting en daarom worden antibiotica in de verschillende kweekmedia gebruikt om het risico op microbiële besmetting van de celcultuur te verminderen. In het bijzonder is mycoplasma een hoog en veel voorkomend risico in celkweek, vanwege de grote verscheidenheid aan effecten op celkweek, resistentie tegen antibiotica die vaak worden gebruikt in celkweek en het feit dat mycoplasmabesmetting alleen kan worden bevestigd door mycoplasma-detectietests. Daarom wordt in de beginfase van celkweek na de isolatie van cellen uit longweefsel de breedspectrum antimicrobiële formulering Primocin gebruikt en tijdens het kweekproces worden willekeurig geselecteerde monsters getest op de aanwezigheid van mycoplasma.
De isolatieprocedure die begint met een bronchiale ring biedt voldoende uitgangsmateriaal om de mate van expansie van deze primaire cellen mogelijk te maken die nodig is om culturen op de ALI te starten zonder de differentiatiecapaciteit in gevaar te brengen. Het starten van de uitbreiding van de geïsoleerde epitheelcellen met een beperkt aantal cellen kan echter problemen opleveren bij het verkrijgen van een voldoende aantal inserts met voldoende cellen die kunnen worden gezaaid voor ALI-cultuur. Uitgebreide kweek en herhaalde passaging van primaire cellen kunnen resulteren in replicatieve senescentie. Er zijn verschillende oplossingen voorgesteld om deze beperking te overwinnen. Horani et al. toonden aan dat de Rho-kinaseremmer (ROCK) Y-27632 de proliferatie van basale cellen30 verhoogde, Mou et al. gebruikten dubbele Smad-remming om basale stamcellen uit te breiden met behoud van de kenmerken van de gedifferentieerde epitheelcellaag 31, en Sachs et al. hebben een luchtwegorganoïde systeem ontwikkeld dat kan worden gebruikt om luchtwegepitheelcellen uit te breiden en hun differentiatiepotentieel te behouden in de loop van meerdere passages32. De laatste methode werd ook gebruikt om cellen uit te breiden uit bronnen met zeer lage celaantallen, zoals tracheale aspiraten (TA’s) van te vroeg geboren baby’s (<28 weken zwangerschapsduur) en bronchoalveolaire lavage (BAL) vloeistof, voordat ze worden overgebracht naar de ALI-cultuur zoals hierbeschreven 33. Het bleek dat cellen geïsoleerd uit BAL en TA’s een differentiatiecapaciteit vertoonden die vergelijkbaar was met cellen gegenereerd uit bronchiaal weefsel, hoewel verschillen werden waargenomen wanneer de differentiatie scheef was in de richting van meer trilhaartjes of meer bokaalcelbevattende culturen met behulp van Notch-signaleringsremming of het Th2-cytokine IL-1333. Het wordt daarom aanbevolen om, als ALI-PBEC’s worden gekweekt uit een uitgangsmateriaal met lage epitheelcelaantallen met behulp van vergelijkbare benaderingen, de culturen altijd te controleren op de basiskwaliteitscriteria, zoals besproken in sectie 6 van het protocol. Belangrijk is dat het gebruik van feedercellen ook kan helpen bij het verkrijgen van grotere celaantallen, wat essentieel is in een omgeving voor transplanteerbare steigertechniek waar tijd en celnummer essentieel zijn. Dit wordt geïllustreerd door een studie waarin autologe epitheelcellen werden gekweekt uit biopten afgeleid van een patiënt met tracheale ziekte en cellen snel werden uitgebreid in aanwezigheid van een muriene embryonale feederlaag (mitotisch geïnactiveerde 3T3-J2 fibroblasten) en de bovengenoemde remmer van de Rho / ROCK-route (Y-27632)34. De resulterende celkweek bleek nuttig te zijn voor herbevolking van tracheale steigers, en daarom kon dit worden gezien als een geschikt protocol voor een transplantatiemodel.
Bij het gebruik van het in deze bijdrage beschreven protocol, maar ook bij het gebruik van andere cultuurprotocollen, ontstaat onvermijdelijk een selectiebias. Het is belangrijk om te beseffen dat verschillen in protocoldetails, zoals de oorsprong van cellen die worden gebruikt om culturen te initiëren, mediumsamenstelling en andere protocoldetails, kunnen leiden tot veranderingen in de cellulaire samenstelling van de culturen en daardoor veranderingen in de respons van de ALI-cultuur33,35. Bovendien zijn er ook verschillen in celeigenschappen waargenomen bij het vergelijken van verschillende media voor het differentiëren van de luchtwegcellen10,11. Bij het vergelijken van PneumaCult en cBD-medium werden verschillen waargenomen in bokaalcel- en clubcel-mRNA-markers, TEER-waarden en cellaagdikte. Op basis van deze observaties, ondanks het gebrek aan statistische onderbouwing, vanwege het lage aantal gebruikte donoren, de samenstelling van het medium is onbekend bij klanten en hogere kosten van het PneumaCult-medium, werd in ons laboratorium besloten om cBD-medium te gebruiken.
Zoals besproken, kunnen cellen in eerste instantie worden uitgebreid met behulp van organoïde cultuur en vervolgens worden overgebracht naar het 2D ALI-insertsysteem. Dit is belangrijk, omdat luchtwegepitheelorganoïden niet geschikt zijn voor blootstelling aan stoffen in de lucht, terwijl het gebruik van het ALI 2D-systeem het mogelijk maakt om de impact van stoffen in de lucht zoals sigarettenrook23,36 op gekweekte luchtwegepitheelcellen te evalueren. Een andere benadering voor het vaststellen van ALI-luchtwegepitheelcelculturen is het genereren van luchtwegepitheelcellen door de differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen (hiPSC’s)37. In dergelijke protocollen kunnen cellen in de laatste fase van het differentiatieprotocol na differentiatie naar proximale luchtwegvoorlopercellen per kweek worden gedifferentieerd naar de ALI met behulp van procedures die vergelijkbaar zijn met de hier beschreven procedures.
In het huidige protocol wordt cBD-medium gebruikt voor cultuur in het ALI. cBD-medium is een serumvrij medium dat wordt bereid door een mix van verschillende supplementen toe te voegen, geïnspireerd door Fulcher et al.38 en andere studies. De supplementoplossing bevat 52 μg/ml runderhypofyse-extract (BPE), 0,5 μg/ml hydrocortison, 0,5 ng/ml humaan EGF, 0,5 μg/ml epinefrine, 10 μg/ml transferrine, 5 μg/ml insuline, 6,5 ng/ml triiodothyronine en 0,1 ng/ml RA39. Aangezien BPE een weefselextract is en onderhevig is aan batchgewijze variatie, kan het medium niet worden beschouwd als een volledig gedefinieerd medium en is het ook niet diervrij. Celkweekmedium dat volledig is gedefinieerd, heeft de voorkeur om batch-tot-batchverschillen te minimaliseren. Met het oog op de overgang naar proefdiervrij onderzoek is het belangrijk dat er inspanningen worden geleverd voor de productie van gedefinieerde media die geen dierlijke producten bevatten en die betaalbaar zijn voor de wetenschappelijke gemeenschap.
Afhankelijk van de onderzoeksvraag kunnen verschillende experimentele opstellingen worden gebruikt op basis van het ALI-model. Om bijvoorbeeld de impact van verbindingen te onderzoeken die het differentiatieproces kunnen beïnvloeden, kan dit worden aangepakt door de verbindingen aan de cultuur toe te voegen tijdens de verschillende stadia van ondergedompelde cultuur, tijdens differentiatie of in het goed gedifferentieerde stadium. De cellulaire samenstelling van de ALI-PBEC-cultuur kan worden beïnvloed door specifieke verbindingen toe te voegen; bijvoorbeeld, het differentiëren van ALI-PBECs in de aanwezigheid van IL-13 genereert een cultuur met meer bokaalcellen en minder trilhaarcellen, terwijl behandeling met de γ-secretaseremmer DAPT (gebruikt om Notch-signalering te blokkeren) tijdens differentiatie resulteert in een cultuur met meer trilhaarcellen ten koste van bokaalcellen 23,40,41,42.
Bovendien kunnen middelen om cellen te stimuleren of bepaalde processen te blokkeren worden toegepast op het basale compartiment of (in een zeer klein volume) op het apicale compartiment van de cultuur. Cellen kunnen ook worden blootgesteld aan stoffen in de lucht vanaf de apicale kant. Dergelijke blootstellingsontwerpen zijn gebruikt om het effect van dieseluitlaatgassen of hele sigarettenrook op PBECs23,43,44 te bestuderen. Het medium kan worden geoogst telkens wanneer het medium wordt veranderd om uitgescheiden eiwitten aan de basale kant te controleren; hetzelfde geldt voor de apicale kant van de cellen die wordt gewassen met PBS terwijl het basale medium wordt ververst. De zogenaamde apicale was wordt geoogst en optioneel dithioerythritol (DTE) wordt toegevoegd om het slijm dat door de bokaalcellen wordt geproduceerd efficiënter te dissociëren. Cellysaten kunnen worden verkregen voor isolatie van totaal eiwit, RNA en chromosomaal en mitochondriaal DNA. De cellen kunnen verder worden bestudeerd met behulp van antilichamen voor specifieke markers, door het polyethyleentereftalaat (PET) -membraan uit de plastic insert te snijden en dit membraan verder in kleinere stukjes te snijden voor meerdere immunofluorescentiekleuringen45. Bovendien kan flowcytometrie of FACS ook worden gebruikt na trypsinisatie van de cellen in de inserts. Tijdens de ALI-fase kan de ontwikkeling van de cellulaire barrière worden gevolgd door de elektrische weerstand te meten en vervolgens de TEER te berekenen, waarbij de elektrische weerstand omgekeerd evenredig is met het oppervlak van de membraaninzet. De berekening is gebaseerd op de wet van Ohm met behulp van de volgende formule: , waarbij Rm de gemeten elektrische weerstand is, Rb de basislijn elektrische weerstand van een wisselplaat zonder coating en cellen, en SA het oppervlak van het membraan van de insert is. Het meten van de elektrische weerstand met behulp van EVOM2- en STX/chopstick-elektroden is eenvoudig, maar sterk afhankelijk van de hanteringsprocedures bij het inbrengen in de put. Ook is gesuggereerd dat de vorm van de elektrode van invloed is op de meting van de barrièrefunctie van het relatief grote oppervlak17.
Verdere verbetering van het ALI-celkweeksysteem, gericht op het verhogen van de nauwkeurige weefselrepresentatie, omvat cocultuur van extra celtypen zoals leukocyten, fibroblasten of endotheelcellen46,47,48. Er is waargenomen dat die co-cultuur van ALI-PBEC met granulocyt-macrofaag koloniestimulerende factor (GM-CSF) of M-CSF-gedifferentieerde macrofagen de aangeboren epitheliale responsen en reparatie aanzienlijk beïnvloedt48. Het is belangrijk op te merken dat in dergelijke cocultuurmodellen gemiddelde compatibiliteit een probleem kan zijn. Aangezien het medium dat wordt gebruikt voor de luchtwegepitheelcelcultuur specifiek is ontwikkeld voor PBECs en mogelijk niet optimaal geschikt is voor andere celtypen, is optimalisatie noodzakelijk. Een ander type vooruitgang op het gebied van luchtwegbiologie waarvoor geïsoleerde PBECs kunnen worden gebruikt, is het gebruik van Organs-on-Chips (OoC) -technologie49,50. Met behulp van deze technologie kan de invloed van de mechanische krachten van ademhaling en bloedstroom, zoals stretch, lucht en mediumstroom, worden bestudeerd 29.
Interdonorvariabiliteit kan significant zijn bij het gebruik van PBECs van verschillende donoren, en daarom is het belangrijk om te overwegen cellen van verschillende donoren te gebruiken om rekening te houden met deze variabiliteit in epitheelcelkweekstudies. Aangezien de kweek van ALI-PBEC’s tijdrovend is en gepaard gaat met aanzienlijke kosten, wordt de optie onderzocht om ALI-PBEC-culturen te vestigen door cellen van verschillende donoren in één celkweekinzet te mengen. Op deze manier kunnen pilotexperimenten gemakkelijk worden uitgevoerd met behulp van primaire cellen, voordat de reacties van culturen afkomstig van verschillende individuele donoren worden geanalyseerd . Bovendien kunnen donoren met verschillende kenmerken (bijvoorbeeld verschillende leeftijdscategorie of geslacht) worden gegroepeerd voor verkennende studies. Bij het gebruik van donormixen is het belangrijk om ervoor te zorgen dat er gelijke celaantallen van verschillende donoren aanwezig zijn, om te voorkomen dat één donor de uitkomsten domineert als gevolg van een hogere proliferatiesnelheid. Daarom worden cellen van individuele donoren afzonderlijk geëxpandeerd en met een hogere dichtheid in de insert gezaaid in vergelijking met zaaicellen van een individuele donor, om proliferatie in de insert te minimaliseren vóór de overgang naar de ALI. Responsen van donormixen en overeenkomstige individuele donoren werden vergeleken door de infectiekinetiek van SARS-CoV-2 te bestuderen. Met behulp van RT-qPCR en immunofluorescentiekleuring werd waargenomen dat de donormix een goede weergave gaf van de verschillende individuele donoren, door vergelijkbare aantallen geproduceerde virusdeeltjes en vergelijkbare aantallen geïnfecteerde cellente tonen 28.
Om een aanvaardbaar alternatief voor diermodellen te worden, moet genbewerking van gekweekte bronchiale epitheelcellen haalbaar zijn51. RNA-interferentietechnologie door gebruik te maken van kleine interfererende RNA’s (siRNA’s) in ALI-PBECs wordt onderzocht, maar aangezien de cellen tijdens de ondergedompelde fase van de cultuur met siRNA moeten worden getransfecteerd, wordt knockdown niet voldoende gehandhaafd tijdens ALI-cultuur vanwege de lange kweekduur, tenzij siRNA-transfectie vaak wordt herhaald tijdens cultuur52. Niettemin kunnen siRNA’s met succes worden gebruikt voor het modificeren van genexpressie in ondergedompelde basale cellen. Anderen hebben met succes CRISPR / Cas9-technologie gebruikt om genbewerking te bereiken in primaire ALI-luchtwegepitheelcelculturen met ribonucleoproteïne (RNP) -levering 53. Bij het gebruik van dergelijke technieken is het essentieel dat de cellen hun volledige differentiatiecapaciteit behouden. Omdat primaire luchtwegcelculturen niet onbeperkt kunnen worden doorgelaten, is klonale expansie van de gen-bewerkte cellen niet eenvoudig en is de toevoeging van medium om getransfecteerde cellen te selecteren omslachtig. Daarom is het moeilijk om de gewenste knockdown in alle gekweekte cellen te bereiken. Een alternatief voor het genereren van knock-out klonen is het gebruik van knock-out strategieën in hiPSCs54 en het gebruik van deze cellen om luchtwegepitheelcellen te genereren. Een ander, zij het suboptimaal, alternatief is het opzetten van een vereeuwigde PBEC-lijn om gen-bewerkte cellen klonaal uit te breiden55.
Het hier gepresenteerde protocol is een manier om een goed gedifferentieerde pseudogestratificeerde ALI-PBEC te genereren, maar er zijn ook andere protocollen gevonden om een dergelijke cultuur tot stand te brengen, met kleinere en grotere verschillen in vergelijking met het gepresenteerde protocol. Naar onze mening zijn laboratoriumvalidatie van kweekmethoden en strenge kwaliteitscontrole essentieel voor het ALI-PBEC-systeem en vergelijkbare kweeksystemen van luchtwegepitheelcellen om een geldig alternatief voor dierproeven te worden.
The authors have nothing to disclose.
De studies met behulp van het model dat in deze bijdrage wordt beschreven, zijn ondersteund door verschillende financieringsorganisaties, waaronder het Longfonds, de Nederlandse Organisatie voor Gezondheidsonderzoek en -ontwikkeling (ZonMw, COVID-19 MKMD-subsidie), de Stichting Proefdiervrij (subsidie #114025007), evenals onderzoekssubsidies van bedrijven als Boehringer Ingelheim en Galapagos. Figuur 1 is gemaakt met BioRender.com.
1,000 ohm test resistor | World Precision Instruments | N/A | Used to calibrate the EVOM2 Epithelial Voltohmmeter |
4-[2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)ethynyl)-benzoic acid (EC 23) | Tocris | 4011 | Used in cBD medium |
6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning | 3506 | Used in the first step to grow the cells isolated form the bronchial ring |
Airway Epithelial Cell Growth Medium Kit | PromoCell | C-21160 | Used to compare to cBD medium |
Bead Bath 20 Liter | Lab Armor | 74220-720 | Used to pre-warm cell culture solutions |
BEGM Bronchial Epithelial Cell Growth Medium BulletKit | LONZA | CC-3170 | Used to compare to cBD medium |
Bovine albumin fraction V (BSA) | Thermo Fisher Scientific | 15260037 | Used in coating solution |
Bovine pituitary extract (BPE) | Thermo Fisher Scientific | 37000-015 | Used in c-KSFM |
Bronchial epithelial cell growth supplement (BEpiCGS) | ScienCell Research Laboratories | 3262 | Used in cBD medium |
Bronchial epithelial cell medium-basal (BEpiCM-b) | ScienCell Research Laboratories | SCC3211-b | Used in cBD medium |
Cell culture inserts; 12 mm Transwell with 0.4 µm pore polyester membrane insert | Corning | 3460 | Cell culture inserts used in the protocol |
Cell culture inserts; 12-well inserts, 0.4 µm PET clear | CellQART made by SABEU | 9310412 | Cell culture inserts used to compare with Corning cell culture inserts |
Cell culture inserts; 12-well ThinCert Tissue culture Inserts | Greiner Bio-One | 82050-032 | Cell culture inserts used to compare with Corning cell culture inserts |
CELLSTAR flask, TC, PS, 250 ml, 75 cm2 | Greiner Bio-One | 658170 | Used to expand the number cells |
CFX Maestro 1.0 | Bio-Rad | N/A | Software program for analyzing qPCR data generated with the CFX384 System |
CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855484 | qPCR detection system |
Chopstick electrode set | World Precision Instruments | STX2 | Used to measure electrical resistance in ALI-PBEC |
CO2-Incubator | PHCbi | MCO-170AICUV-PE | Cell culture incubator used for mycplasma free cell cultures |
CO2-Incubator | Hereaus | Heracell 150 | Cell culture incubator used for possibly mycplasma infected cell cultures |
Coolcell Container | Corning | 432006 | Used to cryopreserve cells at -80 °C before transfer to liquid N2 |
Countess 3 Automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX2000 | Used to count cells and determine the cell concentration |
Cryovials | Nalgene | 479-3224 | Used to cryopreserve cells in |
D-Glucose | Avantor VWR BDH CHEMICALS | 101174Y | Used in soft trypsin |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Avantor VWR | 0231 | Used in cell freeze medium |
dNTP (10 mM) | Promega | U1515 | Used in the synthesis of cDNA |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) + 4500 mg/l D-Glucose | STEMCELL Technologies | 36250 | Used in cBD medium |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 4.5 g/l glucose with l-glutamine | LONZA | LOBE12-604F | Used in cBD medium to compare with DMEM from other manufacturers |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 41966029 | Used in cBD medium to compare with DMEM from other manufacturers |
Epidermal growth factor (EGF) | Thermo Fisher Scientific | 37000-015 | Used in c-KSFM |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Avantor VWR BDH CHEMICALS | 443885J | Used in soft trypsin |
EVOM2 Epithelial Voltohmmeter | World Precision Instruments | 91799 | Used with the chopstick electrode set to measure electrical resistance in ALI-PBEC |
Fibronectin solution, Human | PromoCell | C-43060 | Used in coating solution |
Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | Used in cBD medium |
Hanks balanced salt solution (HBSS) | ScienCell Research Laboratories | SCC0313 | Used to dissolve protease XIV |
IQ SYBR Green Super mix | Bio-Rad | 170887 | qPCR reagent |
Isoproterenol hydrochloride, (-)- | Sigma-Aldrich | I-6504 | Used in c-KSFM |
Keratinocyte-SFM (KSFM) | Thermo Fisher Scientific | 17005-034 | Used in c-KSFM |
Maxwell RSC Instrument | Promega | AS4500 | Automated RNA isolation system |
Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit | Promega | AS1340 | Used to isolate total RNA with the Maxwell RSC Instrument |
M-MLV Reverse transcriptase | Promega | M5301 | Used in the synthesis of cDNA |
M-MLV Reverse transcriptase 5X reaction buffer | Promega | M531A | Used in the synthesis of cDNA |
MycoStrip | InvivoGen | rep-mys-10 | Used to detect the presence of mycoplasma in cell culture samples |
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) | Thermo Fisher Scientific | 15630056 | Used in cBD medium |
Oligo(dT)15 | Qiagen | 79237 | Used in the synthesis of cDNA |
Penicillin/Streptomycin solution (Pen/Strep) | ScienCell Research Laboratories | SCC0513 | Used as antibiotic in c-KSFM and cBD medium |
Phosphate buffered saline (PBS) | LUMC pharmacy | N/A | Used in different steps of the protocol |
Pneumacult-ALI Medium | STEMCELL Technologies | 05002 | Used to grow cells in the differentiation stage to compare to cBD medium |
Pneumacult-Ex Plus Medium | STEMCELL Technologies | 05040 | Used to grow cells in the submerged stage to compare to cBD medium |
Primer, ATP5B, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: TCACCCAGGCTGGTTCAGA |
Primer, ATP5B, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: AGTGGCCAGGGTAGGCTGAT |
Primer, FOXJ1, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: GGAGGGGACGTAAATCCCTA |
Primer, FOXJ1, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: TTGGTCCCAGTAGTTCCAGC |
Primer, MUC5AC, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: CCTTCGACGGACAGAGCTAC |
Primer, MUC5AC, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: TCTCGGTGACAACACGAAAG |
Primer, MUC5B, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: GGGCTTTGACAAGAGAGT |
Primer, MUC5B, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: AGGATGGTCGTGTTGATGCG |
Primer, RPL13A, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: AAGGTGGTGGTCGTACGCTGTG |
Primer, RPL13A, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: CGGGAAGGGTTGGTGTTCATCC |
Primer, SCGB1A1, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: ACATGAGGGAGGCAGGGGCTC |
Primer, SCGB1A1, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: ACTCAAAGCATGGCAGCGGCA |
Primer, TP63, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: CCACCTGGACGTATTCCACTG |
Primer, TP63, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: TCGAATCAAATGACTAGGAGGGG |
Primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | Used as antimicrobial agent against bacteria, mycoplasma, and fungi in c-KSFM medium |
Protease XIV | Sigma-Aldrich | P5147 | Used for the enzymatic treatment of the bronchial ring |
RNAsin Recombinant Ribonuclease inhibitor | Promega | N2515 | Used in the synthesis of cDNA |
Soybean trypsin inhibitor (SBTI) | Sigma-Aldrich | T9128 | Used to inhibit the action of soft trypsin |
T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | Used in the synthesis of cDNA |
TissueSAFE plus | MILESTONE MEDICAL | N/A | Vacuum transfer system for biological specimens |
Trypan blue solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Used to count live- and dead cells |
Trypsin 1:250 | Thermo Fisher Scientific | 27250-018 | Used in soft trypsin |
Type I collagen solution (PureCol) | Advanced BioMatrix | 5005-B | Used in coating solution |
Universal container, PP, with PE screw cap | Avantor VWR | 216-2053 | Used in the protocol for the Protease XIV treatment of the bronchial ring |