Presentato qui è un metodo riproducibile, economico e robusto per l’isolamento e l’espansione delle cellule epiteliali bronchiali primarie per il biobanking a lungo termine e la generazione di cellule epiteliali differenziate mediante coltura all’interfaccia aria-liquido.
Lo strato di cellule epiteliali delle vie aeree costituisce la prima barriera tra il tessuto polmonare e l’ambiente esterno ed è quindi costantemente esposto a sostanze inalate, compresi agenti infettivi e inquinanti atmosferici. Lo strato epiteliale delle vie aeree svolge un ruolo centrale in una grande varietà di malattie polmonari acute e croniche e vari trattamenti mirati a questo epitelio vengono somministrati per inalazione. Comprendere il ruolo dell’epitelio nella patogenesi e come può essere mirato alla terapia richiede modelli robusti e rappresentativi. I modelli di coltura epiteliale in vitro sono sempre più utilizzati e offrono il vantaggio di eseguire esperimenti in un ambiente controllato, esponendo le cellule a diversi tipi di stimoli, tossici o agenti infettivi. L’uso di cellule primarie al posto di linee cellulari immortalizzate o tumorali ha il vantaggio che queste cellule si differenziano in coltura per uno strato cellulare epiteliale polarizzato pseudostratificato con una migliore rappresentazione dell’epitelio rispetto alle linee cellulari.
Qui è presentato un protocollo robusto, che è stato ottimizzato negli ultimi decenni, per l’isolamento e la coltura di cellule epiteliali delle vie aeree dal tessuto polmonare. Questa procedura consente di isolare, espandere, coltivare e differenziare mucociliare con successo le cellule epiteliali bronchiali primarie (PBEC) mediante coltura all’interfaccia aria-liquido (ALI) e include un protocollo per il biobanking. Inoltre, viene descritta la caratterizzazione di queste colture utilizzando geni marcatori cellula-specifici. Queste colture ALI-PBEC possono essere utilizzate per una vasta gamma di applicazioni, tra cui l’esposizione al fumo di sigaretta intero o ai mediatori infiammatori e la co-coltura / infezione con virus o batteri.
Il protocollo fornito in questo manoscritto, che illustra la procedura in modo graduale, dovrebbe fornire una base e / o un riferimento per coloro che sono interessati a implementare o adattare tali sistemi di coltura nel loro laboratorio.
Il ruolo dell’epitelio delle vie aeree in una varietà di malattie polmonari acute e croniche è stato descritto in varie revisioni 1,2,3,4,5,6,7. Colture ben differenziate di cellule epiteliali delle vie aeree sono uno strumento importante per svelare il ruolo dell’epitelio delle vie aeree. La coltura di cellule epiteliali delle vie aeree con interfaccia aria-liquido (ALI) è ampiamente applicata per promuovere la differenziazione delle cellule epiteliali basali delle vie aeree e quindi studiare l’epitelio delle vie aeree in modo affidabile in vitro 8,9. Negli ultimi anni, l’uso di tali modelli è aumentato ulteriormente a seguito di nuove iniziative di ricerca legate alla pandemia di COVID-19 e di una transizione mondiale verso la ricerca senza animali. Pertanto, l’aumento dell’uso di questa linea cellulare modello sottolinea la necessità di condividere procedure ed esperienze per ottenere risultati solidi. Ciò consentirà anche il confronto dei risultati tra gruppi di ricerca. La robustezza della procedura è la caratteristica chiave e quindi deve essere sottoposta a controllo di qualità. Diversi laboratori hanno investito nello sviluppo di protocolli per la coltura di cellule epiteliali primarie delle vie aeree presso l’ALI. Il tempo, l’impegno e il budget richiesto possono essere ridotti quando queste procedure sono condivise in dettaglio. Questi dettagli includono, ad esempio, la scelta di plastiche e terreni di coltura cellulare forniti da vari produttori, poiché si è scoperto che ciò influenza le caratteristiche delle colture ottenute10,11,12. Ciò sottolinea l’importanza di condividere esperienze e dettagli delle procedure colturali, poiché in assenza di tali approfondimenti, i risultati possono essere influenzati e / o gli sforzi di convalida tra i vari laboratori possono essere ostacolati.
L’epitelio polmonare umano comprende vari tipi di cellule, compresi i tipi principali come cellule basali, cellule ciliate, cellule caliciformi e cellule club. Al fine di imitare in modo affidabile lo strato cellulare epiteliale nelle vie aeree in vitro, questi tipi di cellule devono essere rappresentati nei modelli di coltura e la loro polarizzazione e funzione mantenute13,14,15,16. La consapevolezza che le caratteristiche del donatore (incluso lo stato di malattia) e l’origine anatomica delle cellule (cioè vie aeree nasali, tracheali, grandi e piccole) possono influenzare la composizione cellulare e le risposte funzionali della coltura cellulare è altrettanto importante. Le competenze e le pratiche pertinenti sono un prerequisito per coltivare con successo cellule epiteliali primarie delle vie aeree e valutare la qualità della coltura sia intuitivamente (mediante ispezione visiva durante la coltura) che quantificabile. Lo scopo di questo contributo è quello di fornire un metodo economico e tempestivo per l’isolamento e la coltura di cellule epiteliali bronchiali umane primarie (PBEC) che può essere applicato anche alla coltura di cellule epiteliali tracheali e delle piccole vie aeree. Oltre a descrivere un metodo per isolare tali cellule dal tessuto polmonare resecato, viene presentato e discusso un metodo per l’espansione e il biobanking e, infine, per la creazione e la caratterizzazione di una coltura ALI ben differenziata entro un ragionevole costo e periodo di tempo.
Il protocollo qui presentato descrive l’isolamento di cellule epiteliali bronchiali umane da tessuto polmonare resecato, un metodo per l’espansione ottimale delle cellule senza perdita di potenziale di differenziazione, una procedura di crioconservazione e una procedura per generare colture ALI-PBEC ben differenziate. Inoltre, viene fornita una descrizione del controllo di qualità, nonché istruzioni per il monitoraggio e la valutazione degli ALI-PBEC differenziati.
Il protocollo descritto inizia con un anello bronchiale macroscopicamente normale, privo di tumore che viene resecato da un lobo polmonare da pazienti sottoposti a intervento chirurgico correlato alla loro diagnosi di cancro del polmone. Va quindi notato che questi anelli non possono essere considerati strettamente come tessuto sano, che può quindi influenzare le caratteristiche della coltura cellulare. Le fonti alternative per ottenere cellule epiteliali bronchiali includono l’utilizzo di biopsie bronchiali, spazzole bronchiali o tessuti da un donatore di trapianto o polmoni riceventi. Indipendentemente dalla fonte, quando si utilizza il tessuto polmonare, deve essere considerato un rischio di contaminazione microbica, e quindi gli antibiotici vengono utilizzati nei diversi terreni di coltura per ridurre il rischio di contaminazione microbica della coltura cellulare. In particolare, il micoplasma è un rischio elevato e comune nella coltura cellulare, a causa della sua ampia varietà di effetti sulla coltura cellulare, della resistenza agli antibiotici comunemente usati nelle colture cellulari e del fatto che la contaminazione da micoplasma può essere confermata solo dai saggi di rilevamento del micoplasma. Pertanto, nella fase iniziale della coltura cellulare dopo l’isolamento delle cellule dal tessuto polmonare, viene utilizzata la formulazione antimicrobica ad ampio spettro Primocin e, durante il processo di coltura, vengono testati campioni selezionati casualmente per la presenza di micoplasma.
La procedura di isolamento che inizia con un anello bronchiale fornisce materiale di partenza sufficiente per consentire il grado di espansione di queste cellule primarie necessarie per avviare le colture presso l’ALI senza compromettere la capacità di differenziazione. Tuttavia, iniziare l’espansione delle cellule epiteliali isolate con un numero limitato di cellule può porre problemi con l’ottenimento di un numero sufficiente di inserti con abbastanza cellule che possono essere seminate per la coltura di ALI. La coltura prolungata e il passaggio ripetuto delle cellule primarie possono provocare senescenza replicativa. Sono state proposte varie soluzioni per superare questa limitazione. Horani et al. hanno dimostrato che l’inibitore della Rho chinasi (ROCK) Y-27632 ha aumentato la proliferazione delle cellule basali30, Mou et al. hanno usato la doppia inibizione di Smad per espandere le cellule staminali basali mantenendo le caratteristiche dello strato di cellule epiteliali differenziate 31, e Sachs et al. hanno sviluppato un sistema organoide delle vie aeree che può essere utilizzato per espandere le cellule epiteliali delle vie aeree e mantenere il loro potenziale di differenziazione nel corso di passaggi multipli32. Quest’ultimo metodo è stato utilizzato anche per espandere cellule da fonti con numero di cellule molto basso, come aspirati tracheali (TA) da neonati pretermine (<età di gestazione di 28 settimane) e liquido di lavaggio broncoalveolare (BAL), prima del trasferimento alla coltura ALI come descritto qui33. È stato riscontrato che le cellule isolate da BAL e TA mostravano una capacità di differenziazione simile alle cellule generate dal tessuto bronchiale, sebbene siano state osservate differenze quando la differenziazione è stata inclinata verso colture più ciliate o più contenenti cellule caliciali utilizzando l’inibizione della segnalazione di Notch o la citochina Th2 IL-1333. Si raccomanda pertanto che, se gli ALI-PBEC sono coltivati a partire da un materiale di partenza con un basso numero di cellule epiteliali utilizzando approcci simili, di controllare sempre le colture per i criteri di qualità di base, come discusso nella sezione 6 del protocollo. È importante sottolineare che l’uso di cellule di alimentazione può anche aiutare a ottenere numeri di cellule più grandi, che è essenziale in un contesto per l’ingegneria delle impalcature trapiantabili in cui il tempo e il numero di cellule sono essenziali. Ciò è illustrato da uno studio in cui cellule epiteliali autologhe sono state coltivate da biopsie derivate da un paziente con malattia tracheale e le cellule sono state rapidamente espanse in presenza di uno strato di alimentazione embrionale murino (fibroblasti 3T3-J2 mitoticamente inattivati) e del suddetto inibitore della via Rho / ROCK (Y-27632) 34. La coltura cellulare risultante si è rivelata utile per il ripopolamento degli scaffold tracheali, e quindi questo potrebbe essere visto come un protocollo adatto per un modello di trapianto.
Quando si utilizza il protocollo descritto in questo contributo, ma anche quando si utilizzano altri protocolli culturali, viene inevitabilmente introdotto un bias di selezione. È importante rendersi conto che le differenze nei dettagli del protocollo, come l’origine delle cellule utilizzate per avviare le colture, la composizione del terreno e altri dettagli del protocollo, possono portare a cambiamenti nella composizione cellulare delle colture e quindi cambiamenti nella risposta della coltura ALI33,35. Inoltre, sono state osservate differenze nelle proprietà cellulari anche confrontando diversi mezzi per differenziare le cellule delle vie aeree10,11. Confrontando PneumaCult e il mezzo cBD, sono state osservate differenze nei marcatori mRNA delle cellule caliciformi e delle cellule club, nei valori TEER e nello spessore dello strato cellulare. Sulla base di queste osservazioni, nonostante la mancanza di basi statistiche, a causa del basso numero di donatori utilizzati, la composizione del mezzo è sconosciuta ai clienti e dei costi più elevati del mezzo PneumaCult, nel nostro laboratorio è stata presa la decisione di utilizzare il mezzo cBD.
Come discusso, le cellule possono essere inizialmente espanse utilizzando la coltura di organoidi e successivamente trasferite al sistema di inserti ALI 2D. Questo è importante, poiché gli organoidi epiteliali delle vie aeree non sono adatti all’esposizione a sostanze aerodisperse, mentre l’uso del sistema ALI 2D consente di valutare l’impatto di sostanze aerodisperse come il fumo di sigaretta23,36 sulle cellule epiteliali delle vie aeree in coltura. Un approccio diverso per stabilire colture di cellule epiteliali delle vie aeree ALI consiste nel generare cellule epiteliali delle vie aeree mediante la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti umane (hiPSCs)37. In tali protocolli, nella fase finale del protocollo di differenziazione dopo la differenziazione in progenitori prossimali delle vie aeree, le cellule possono essere differenziate per coltura all’ALI utilizzando procedure simili a quelle qui descritte.
Nel protocollo attuale, il mezzo cBD viene utilizzato per la coltura presso l’ALI. Il mezzo cBD è un mezzo privo di siero che viene preparato aggiungendo un mix di diversi integratori, ispirato da Fulcher et al.38 e da altri studi. La soluzione di supplemento contiene 52 μg/mL di estratto ipofisario bovino (BPE), 0,5 μg/mL idrocortisone, 0,5 ng/mL EGF umano, 0,5 μg/mL epinefrina, 10 μg/mL transferrina, 5 μg/mL di insulina, 6,5 ng/mL di triiodotironina e 0,1 ng/mL di RA39. Poiché il BPE è un estratto tissutale ed è soggetto a variazioni per lotti, il mezzo non può essere considerato un mezzo completamente definito, né è privo di animali. Il terreno di coltura cellulare completamente definito è preferibile per ridurre al minimo le differenze tra batch. In vista della transizione verso una ricerca senza animali, è importante che si compiano sforzi per produrre terreni definiti che non contengano prodotti animali e che siano accessibili per la comunità scientifica.
Varie configurazioni sperimentali possono essere utilizzate sulla base del modello ALI, a seconda della domanda di ricerca. Ad esempio, per studiare l’impatto dei composti che possono influenzare il processo di differenziazione, questo può essere affrontato aggiungendo i composti alla coltura durante le diverse fasi della coltura sommersa, durante la differenziazione o nella fase ben differenziata. La composizione cellulare della coltura ALI-PBEC può essere influenzata dall’aggiunta di composti specifici; ad esempio, differenziando gli ALI-PBEC in presenza di IL-13 si genera una coltura con più cellule caliciformi e meno cellule ciliate, mentre il trattamento con l’inibitore della γ-secretasi DAPT (usato per bloccare la segnalazione di Notch) durante la differenziazione si traduce in una coltura con più cellule ciliate a spese delle cellule caliciformi 23,40,41,42.
Inoltre, gli agenti per stimolare le cellule o bloccare determinati processi possono essere applicati al compartimento basale o (in un volume molto piccolo) al compartimento apicale della coltura. Le cellule possono anche essere esposte a sostanze aerodisperse dal lato apicale. Tali modelli di esposizione sono stati utilizzati per studiare l’effetto dei gas di scarico diesel o del fumo di sigaretta intero sui PBEC23,43,44. Il terreno può essere raccolto ogni volta che il terreno viene cambiato per monitorare le proteine secrete sul lato basale; lo stesso vale per il lato apicale delle cellule che viene lavato con PBS mentre rinfresca il mezzo basale. Il cosiddetto lavaggio apicale viene raccolto e viene aggiunto ditioeritritolo opzionale (DTE) per dissociare il muco prodotto dalle cellule caliciformi in modo più efficiente. Gli lisati cellulari possono essere ottenuti per l’isolamento di proteine totali, RNA e DNA cromosomico e mitocondriale. Le cellule possono essere ulteriormente studiate utilizzando anticorpi per marcatori specifici, tagliando la membrana di polietilene tereftalato (PET) dall’inserto di plastica e tagliando ulteriormente questa membrana in pezzi più piccoli per colorazioni multiple di immunofluorescenza45. Inoltre, la citometria a flusso o FACS può essere utilizzata anche dopo tripsinizzazione delle cellule negli inserti. Durante la fase ALI, lo sviluppo della barriera cellulare può essere monitorato misurando la resistenza elettrica e successivamente calcolando il TEER, dove la resistenza elettrica è inversamente proporzionale alla superficie dell’inserto della membrana. Il calcolo si basa sulla legge di Ohm utilizzando la seguente formula: , in cui Rm è la resistenza elettrica misurata, Rb è la resistenza elettrica di base di un inserto senza rivestimento e celle e SA è l’area superficiale della membrana dell’inserto. La misurazione della resistenza elettrica utilizzando elettrodi EVOM2 e STX / bacchette è semplice, ma dipende fortemente dalle procedure di manipolazione quando viene introdotta nel pozzo. Inoltre, è stato suggerito che la forma dell’elettrodo influenzi la misurazione della funzione barriera della superficie relativamente grande17.
Un ulteriore miglioramento del sistema di coltura cellulare ALI, volto ad aumentare la rappresentazione accurata dei tessuti, include la cocoltura di ulteriori tipi cellulari come leucociti, fibroblasti o cellule endoteliali46,47,48. È stato osservato che la co-coltura di ALI-PBEC con il fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF) o i macrofagi differenziati M-CSF influenza marcatamente le risposte epiteliali innate e la riparazione48. È importante notare che in tali modelli di cocultura, la compatibilità media può essere un problema. Poiché il mezzo utilizzato per la coltura di cellule epiteliali delle vie aeree è sviluppato specificamente per i PBEC e potrebbe non essere adatto in modo ottimale per altri tipi di cellule, è necessaria un’ottimizzazione. Un altro tipo di progresso osservato nel campo della biologia delle vie aeree per il quale possono essere utilizzati PBEC isolati è l’uso della tecnologia Organs-on-Chips (OoC)49,50. Utilizzando questa tecnologia, l’influenza delle forze meccaniche della respirazione e del flusso sanguigno, come l’allungamento, l’aria e il flusso medio, può essere studiata 29.
La variabilità tra donatori può essere significativa quando si utilizzano PBEC di vari donatori e pertanto è importante considerare l’utilizzo di cellule di diversi donatori per tenere conto di questa variabilità negli studi di coltura di cellule epiteliali. Poiché la coltura di ALI-PBEC richiede molto tempo e comporta costi considerevoli, viene esaminata l’opzione di stabilire colture ALI-PBEC mescolando cellule di donatori diversi in un inserto di coltura cellulare. In questo modo, gli esperimenti pilota possono essere facilmente eseguiti utilizzando cellule primarie, prima di analizzare le risposte delle colture derivate da vari singoli donatori. Inoltre, i donatori con caratteristiche diverse (ad esempio, diversa categoria di età o sesso) possono essere raggruppati per studi esplorativi. Quando si utilizzano miscele di donatori, è importante assicurarsi che siano presenti numeri di cellule uguali di donatori diversi, per evitare la possibilità che un donatore domini i risultati a causa di un tasso di proliferazione più elevato. Pertanto, le cellule dei singoli donatori vengono espanse separatamente e seminate a una densità più elevata nell’inserto rispetto alle cellule di semina di un singolo donatore, per ridurre al minimo la proliferazione nell’inserto prima della transizione all’ALI. Le risposte dei mix di donatori e dei singoli donatori corrispondenti sono state confrontate studiando la cinetica di infezione di SARS-CoV-2. Utilizzando RT-qPCR e colorazione a immunofluorescenza, è stato osservato che il mix di donatori ha fornito una buona rappresentazione dei vari singoli donatori, mostrando un numero simile di particelle virali prodotte e un numero simile di cellule infette28.
Per diventare un’alternativa accettabile per i modelli animali, l’editing genetico di cellule epiteliali bronchiali in coltura dovrebbe essere fattibile51. Viene esaminata la tecnologia di interferenza dell’RNA utilizzando piccoli RNA interferenti (siRNA) negli ALI-PBEC, tuttavia poiché le cellule devono essere trasfettate con siRNA durante la fase sommersa della coltura, il knockdown non è sufficientemente mantenuto durante la coltura ALI a causa della lunga durata della coltura, a meno che la trasfezione di siRNA non venga frequentemente ripetuta durante la coltura52. Tuttavia, i siRNA possono essere utilizzati con successo per modificare l’espressione genica nelle cellule basali sommerse. Altri hanno utilizzato con successo la tecnologia CRISPR / Cas9 per ottenere l’editing genetico in colture primarie di cellule epiteliali delle vie aeree ALI con rilascio di ribonucleoproteina (RNP) 53. Quando si utilizzano tali tecniche, è essenziale che le cellule mantengano la loro piena capacità di differenziazione. Poiché le colture cellulari primarie delle vie aeree non possono essere passate indefinitamente, l’espansione clonale delle cellule geneticamente modificate non è facile e l’aggiunta di terreno per selezionare le cellule trasfettate è ingombrante. Pertanto, è difficile ottenere il knockdown desiderabile in tutte le cellule coltivate. Un’alternativa per generare cloni knockout è l’uso di strategie knock-out in hiPSCs54 e l’uso di queste cellule per generare cellule epiteliali delle vie aeree. Un’altra alternativa, anche se non ottimale, è stabilire una linea PBEC immortalata per espandere clonalmente le cellule geneticamente modificate55.
Il protocollo presentato qui è un modo per generare un ALI-PBEC pseudostratificato ben differenziato, ma sono stati trovati anche altri protocolli per stabilire una tale cultura, con differenze sempre più piccole rispetto al protocollo presentato. A nostro avviso, attraverso la validazione in laboratorio dei metodi di coltura e un rigoroso controllo di qualità sono essenziali affinché il sistema ALI-PBEC e simili sistemi di coltura di cellule epiteliali delle vie aeree, diventino una valida alternativa per gli esperimenti sugli animali.
The authors have nothing to disclose.
Gli studi che utilizzano il modello descritto in questo contributo sono stati supportati da una varietà di organizzazioni di finanziamento, tra cui la Lung Foundation Netherlands, l’Organizzazione olandese per la ricerca e lo sviluppo sanitario (ZonMw, COVID-19 MKMD grant), la Dutch Society for the Replacement of Animal Testing (Stichting Proefdiervrij, grant #114025007), nonché borse di ricerca di aziende come Boehringer Ingelheim e Galapagos. La Figura 1 è stata creata con BioRender.com.
1,000 ohm test resistor | World Precision Instruments | N/A | Used to calibrate the EVOM2 Epithelial Voltohmmeter |
4-[2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)ethynyl)-benzoic acid (EC 23) | Tocris | 4011 | Used in cBD medium |
6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning | 3506 | Used in the first step to grow the cells isolated form the bronchial ring |
Airway Epithelial Cell Growth Medium Kit | PromoCell | C-21160 | Used to compare to cBD medium |
Bead Bath 20 Liter | Lab Armor | 74220-720 | Used to pre-warm cell culture solutions |
BEGM Bronchial Epithelial Cell Growth Medium BulletKit | LONZA | CC-3170 | Used to compare to cBD medium |
Bovine albumin fraction V (BSA) | Thermo Fisher Scientific | 15260037 | Used in coating solution |
Bovine pituitary extract (BPE) | Thermo Fisher Scientific | 37000-015 | Used in c-KSFM |
Bronchial epithelial cell growth supplement (BEpiCGS) | ScienCell Research Laboratories | 3262 | Used in cBD medium |
Bronchial epithelial cell medium-basal (BEpiCM-b) | ScienCell Research Laboratories | SCC3211-b | Used in cBD medium |
Cell culture inserts; 12 mm Transwell with 0.4 µm pore polyester membrane insert | Corning | 3460 | Cell culture inserts used in the protocol |
Cell culture inserts; 12-well inserts, 0.4 µm PET clear | CellQART made by SABEU | 9310412 | Cell culture inserts used to compare with Corning cell culture inserts |
Cell culture inserts; 12-well ThinCert Tissue culture Inserts | Greiner Bio-One | 82050-032 | Cell culture inserts used to compare with Corning cell culture inserts |
CELLSTAR flask, TC, PS, 250 ml, 75 cm2 | Greiner Bio-One | 658170 | Used to expand the number cells |
CFX Maestro 1.0 | Bio-Rad | N/A | Software program for analyzing qPCR data generated with the CFX384 System |
CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855484 | qPCR detection system |
Chopstick electrode set | World Precision Instruments | STX2 | Used to measure electrical resistance in ALI-PBEC |
CO2-Incubator | PHCbi | MCO-170AICUV-PE | Cell culture incubator used for mycplasma free cell cultures |
CO2-Incubator | Hereaus | Heracell 150 | Cell culture incubator used for possibly mycplasma infected cell cultures |
Coolcell Container | Corning | 432006 | Used to cryopreserve cells at -80 °C before transfer to liquid N2 |
Countess 3 Automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX2000 | Used to count cells and determine the cell concentration |
Cryovials | Nalgene | 479-3224 | Used to cryopreserve cells in |
D-Glucose | Avantor VWR BDH CHEMICALS | 101174Y | Used in soft trypsin |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Avantor VWR | 0231 | Used in cell freeze medium |
dNTP (10 mM) | Promega | U1515 | Used in the synthesis of cDNA |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) + 4500 mg/l D-Glucose | STEMCELL Technologies | 36250 | Used in cBD medium |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 4.5 g/l glucose with l-glutamine | LONZA | LOBE12-604F | Used in cBD medium to compare with DMEM from other manufacturers |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 41966029 | Used in cBD medium to compare with DMEM from other manufacturers |
Epidermal growth factor (EGF) | Thermo Fisher Scientific | 37000-015 | Used in c-KSFM |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Avantor VWR BDH CHEMICALS | 443885J | Used in soft trypsin |
EVOM2 Epithelial Voltohmmeter | World Precision Instruments | 91799 | Used with the chopstick electrode set to measure electrical resistance in ALI-PBEC |
Fibronectin solution, Human | PromoCell | C-43060 | Used in coating solution |
Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | Used in cBD medium |
Hanks balanced salt solution (HBSS) | ScienCell Research Laboratories | SCC0313 | Used to dissolve protease XIV |
IQ SYBR Green Super mix | Bio-Rad | 170887 | qPCR reagent |
Isoproterenol hydrochloride, (-)- | Sigma-Aldrich | I-6504 | Used in c-KSFM |
Keratinocyte-SFM (KSFM) | Thermo Fisher Scientific | 17005-034 | Used in c-KSFM |
Maxwell RSC Instrument | Promega | AS4500 | Automated RNA isolation system |
Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit | Promega | AS1340 | Used to isolate total RNA with the Maxwell RSC Instrument |
M-MLV Reverse transcriptase | Promega | M5301 | Used in the synthesis of cDNA |
M-MLV Reverse transcriptase 5X reaction buffer | Promega | M531A | Used in the synthesis of cDNA |
MycoStrip | InvivoGen | rep-mys-10 | Used to detect the presence of mycoplasma in cell culture samples |
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) | Thermo Fisher Scientific | 15630056 | Used in cBD medium |
Oligo(dT)15 | Qiagen | 79237 | Used in the synthesis of cDNA |
Penicillin/Streptomycin solution (Pen/Strep) | ScienCell Research Laboratories | SCC0513 | Used as antibiotic in c-KSFM and cBD medium |
Phosphate buffered saline (PBS) | LUMC pharmacy | N/A | Used in different steps of the protocol |
Pneumacult-ALI Medium | STEMCELL Technologies | 05002 | Used to grow cells in the differentiation stage to compare to cBD medium |
Pneumacult-Ex Plus Medium | STEMCELL Technologies | 05040 | Used to grow cells in the submerged stage to compare to cBD medium |
Primer, ATP5B, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: TCACCCAGGCTGGTTCAGA |
Primer, ATP5B, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: AGTGGCCAGGGTAGGCTGAT |
Primer, FOXJ1, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: GGAGGGGACGTAAATCCCTA |
Primer, FOXJ1, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: TTGGTCCCAGTAGTTCCAGC |
Primer, MUC5AC, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: CCTTCGACGGACAGAGCTAC |
Primer, MUC5AC, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: TCTCGGTGACAACACGAAAG |
Primer, MUC5B, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: GGGCTTTGACAAGAGAGT |
Primer, MUC5B, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: AGGATGGTCGTGTTGATGCG |
Primer, RPL13A, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: AAGGTGGTGGTCGTACGCTGTG |
Primer, RPL13A, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: CGGGAAGGGTTGGTGTTCATCC |
Primer, SCGB1A1, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: ACATGAGGGAGGCAGGGGCTC |
Primer, SCGB1A1, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: ACTCAAAGCATGGCAGCGGCA |
Primer, TP63, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: CCACCTGGACGTATTCCACTG |
Primer, TP63, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: TCGAATCAAATGACTAGGAGGGG |
Primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | Used as antimicrobial agent against bacteria, mycoplasma, and fungi in c-KSFM medium |
Protease XIV | Sigma-Aldrich | P5147 | Used for the enzymatic treatment of the bronchial ring |
RNAsin Recombinant Ribonuclease inhibitor | Promega | N2515 | Used in the synthesis of cDNA |
Soybean trypsin inhibitor (SBTI) | Sigma-Aldrich | T9128 | Used to inhibit the action of soft trypsin |
T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | Used in the synthesis of cDNA |
TissueSAFE plus | MILESTONE MEDICAL | N/A | Vacuum transfer system for biological specimens |
Trypan blue solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Used to count live- and dead cells |
Trypsin 1:250 | Thermo Fisher Scientific | 27250-018 | Used in soft trypsin |
Type I collagen solution (PureCol) | Advanced BioMatrix | 5005-B | Used in coating solution |
Universal container, PP, with PE screw cap | Avantor VWR | 216-2053 | Used in the protocol for the Protease XIV treatment of the bronchial ring |