Bu protokol, kehanetlerin konakçıları üzerindeki etkisinin ortaya çıkmasını sağlar. Bakteri kültürleri, lizojenik durumu en iyi destekleyen ve spontan indüksiyonu sınırlayan koşullar kullanılarak senkronize edilir. RT-qPCR, kehanet kısıtlı genleri ve faj kontrolünden ayrılmamış genleri, litik replikasyon döngüsü sırasında eksprese edilenlerden kesin olarak ayırır.
Ilıman fajlar, bakteri genomlarının çoğunda kehanetler olarak entegre olarak bulunur. Bazı kehanetler kriptiktir ve bakteri kromozomunda sabittir, ancak diğerleri aktiftir ve kendiliğinden veya indükleyici faktörlere maruz bırakılarak replikatif bir forma tetiklenebilir. Kehanetler genellikle konakçı hücrelerine toksin üretimi veya diğer virülansla ilişkili özellikler kazandırma yeteneği ile ilişkilidir. Daha yeni çalışmalar, konakçılarının fizyolojisini değiştirmede çok daha büyük bir rol oynayabileceklerini göstermiştir. Burada açıklanan teknik, fırsatçı bakteri Pseudomonas aeruginosa’da kehanetlerin gen ekspresyonunu nasıl etkilediğini araştırmamızı sağlamıştır.
Bu çalışmada, vahşi tip P. aeruginosa suşu PAO1’in büyümesi, Liverpool Epidemik Suşu (LES) LESB58’den farklı kehanet kombinasyonları taşıyan izojenik lizojenlerinkiyle karşılaştırıldı. Bir lizojen kültüründe, bakteri hücrelerinin bir kısmı, faj parçacıklarının montajı ile ilişkili olanlar gibi, geç faj genlerinin hücre başına yüksek düzeyde ekspresyon ile litik bakteriyofaj replikasyonunu (spontan indüksiyon) destekleyecektir, böylece lizojen kısıtlı gen ekspresyonu ile ilişkili düşük seviyeli gen ekspresyonunu maskeleyecektir. Spontan indüksiyonun etkisi, bu nedenle, bir lizojen popülasyonunda kehanet gen ekspresyonunu gizleyebilir.
Erken üstel büyüme fazında minimal olan spontan indüksiyonu tanımlamak için büyüme profili oluşturma deneyleri kullanıldı. Bu çalışma, erken üstel büyüme aşamasında örnek kültürlerin nasıl hazırlanacağını ve düşük hücre sayılarına rağmen yeterli kontrollerin nasıl kurulacağını bildirmektedir. Bu protokoller, çeşitli koşullar altında vahşi tip ve lizojenik bakterilerin güvenilir ve tekrarlanabilir bir şekilde karşılaştırılmasını sağlar, böylece kehanet genomlarının transkriptomik profillemesini geliştirir ve daha önce tanınmayan kehanet işlevlerinin tanımlanmasına yardımcı olur.
Son zamanlarda, antimikrobiyal dirençle mücadele için faj tedavisi1 ve CRISPR-Cas tabanlı gen düzenleme2, bakteriyofaj araştırmalarına olan ilgiyi yeniden artırdı. Yine, biyoteknolojideki gelişmeler, bakteri ve fajlar arasındaki etkileşimlerin daha derinlemesine araştırılmasını sağlamıştır3. Bununla birlikte, fajın terapötik kullanımı (“faj tedavisi”), virülans ve direnç genlerini yatay olarak aktarma kapasitesine sahip mobil genetik elemanlar olarak hareket eden fajlarla ilgili endişeler nedeniyle engellenmektedir4. “Karanlık maddenin“5 (bilinmeyen işlevlere sahip genler) genişliği hem rahatsız edici hem de caziptir. Karanlık madde, faj biyolojisi anlayışımızda bir boşluk ve moleküler araçlar ve potansiyel yeni terapötikler için büyük ölçüde kullanılmayan bir kaynak olarak kabul edilir6. Geliştirilmiş gen açıklama 7,8,9 ve yeni peptit katlama algoritmaları10 ile birlikte yüksek verimli dizileme tekniklerinin geliştirilmesi, faj genlerinin tespitini, tanımını ve işlevsel tahminini iyileştirmektedir. Bununla birlikte, bilim, çoğu fajın gen fonksiyonlarını kültürde veya gerçek dünyada doğrulamaktan hala uzaktır.
RNA dizilimi (RNA-Seq), faj enfeksiyonu sırasında gen ekspresyonunu küresel olarak haritalayabilir ve litik ve lizojenik döngülerde yer alan hem faj hem de bakteriyel elementlerin anlaşılmasını önemli ölçüde geliştirmiştir11,12. Lizojenik süreçler sırasında, ılıman faj genomları, kehanetler haline gelmek üzere bakteri DNA’sına entegre edilir13. Küresel gen ekspresyonu profilleme deneyleri, ılıman faj genomlarında kodlanan, ancak yalnızca lizojenik durum11 sırasında ifade edilen kehanet kısıtlı genleri tanımlamak için kullanılabilir. Bu tür genler, faj yapısal proteinlerini kodlamaz ve herhangi bir faj enfeksiyonu sürecine dahil değildir. RNA-Seq, ya bir işlev kazancı indükleyerek ya da mevcut bakteri genlerini düzenleyerek, bakteri konakçısının biyolojisini etkileme olasılığı daha yüksek olan genleri tanımlamak için kullanılabilir, böylece genellikle bakterilerin değişen ortamlara uyum sağlamasını sağlar. Bu nedenle, kehanetlerin bir dizi bakteri fonksiyonunu kontrol eden mikrobiyal kukla ustaları olarak hareket etme yeteneği incelenebilir.
Kehanet kısıtlı gen ekspresyonunun etkili analizinin önünde iki büyük engel vardır. İlk olarak, duyarlı ana bilgisayarların mevcudiyeti önemli bir konudur. Tanım olarak, kehanetler zaten spesifik konakçı genomlarına dahil edilmiştir, bu nedenle kehanetin varlığında ve yokluğunda küresel gen ekspresyonunu karşılaştırmak için duyarlı bir vahşi tip konakçı bulmak zordur. Bu, ya başka bir duyarlı konakçının de novo enfeksiyonu ya da konakçı genomunun geri kalanını bozmadan orijinal vahşi tip izolattan kehanetin silinmesi yoluyla başarılabilir. İkinci engel, lizojenik popülasyonların heterojen doğasında yatmaktadır. Bazı kehanetler, mutasyon veya rekombinasyon yoluyla “kriptik” hale gelir, yani bakteri genomunun belirli bir yerinde sabitlenirler. Bununla birlikte, diğer kehanetler “aktiftir” ve kendiliğinden veya indükleyici faktörlere maruz kaldıktan sonra replikatif, litik bir döngüye indüklenebilir. Birçok lizojenik kültürde, spontan indüksiyon hızı, bakteri hücrelerinin bir kısmının her zaman litik faj replikasyonuna uğradığı anlamına gelir14,15,16. Bu popülasyonlarda geç faj genlerinin yüksek düzeyde ekspresyonu, lizojen kısıtlı gen ekspresyonu ile ilişkili düşük seviyeli gen ekspresyonunu maskelemektedir11,17. Spontan kehanet indüksiyonu geçiren lizojenlerin oranı, büyüme durumuna, büyüme koşullarına veya diğer tetikleyicilere göre değişebilir. Bu nedenle, kehanetlerin lizojen üzerindeki etkilerini incelemek için, büyüme koşullarını lizojenik durumu destekleyecek şekilde optimize ederek spontan kehanet indüksiyon olayları mümkün olduğunca en aza indirilmelidir.
Bu çalışma, Pseudomonas aeruginosa’nın Liverpool Salgın Suşundan (LES) bir dizi birlikte yaşama kehanetinin etkisini araştırmak için yapılan hazırlık çalışmalarını bildirmektedir. Aktif kehanetler indüklendi ve LES’den izole edildi ve model P. aeruginosa konak suşu, PAO116,18,19’u enfekte etmek için kullanıldı. Yabani tip P. aeruginosa suşunun tüm genomları, PAO1 ve lizojeni PAO1Φ2, vahşi tip suşun kimliğini sağlamak ve lizojenin izojenik olduğunu doğrulamak için (30x kapsama derinliğinde) dizilendi. LES, kistik fibrozis hastalarında artmış morbidite ve mortalite ile ilişkilendirilmiştir ve LES fajlarının 19 kistik fibrozis akciğer ortamına adaptasyona yardımcı olduğu öne sürülmüştür16,19,20. Bu kehanetlerin konakçılarının biyolojisini etkilediğine dair güçlü kanıtlara rağmen20,21, gen fonksiyonlarının çoğu henüz karakterize edilmemiştir ve spesifik etkileşim mekanizmaları tam olarak anlaşılamamıştır. Bir transkriptomik yaklaşım, kontrollü bir konakçı arka planında kehanet geni fonksiyonlarını ampirik olarak ortaya çıkarabilir. Spontan indüksiyon ekspresyon profillerini etkileyebileceğinden, bu makalede lizojenik durumu desteklemek için büyüme koşullarının nasıl optimize edileceği açıklanmaktadır. Kültürlerin bu tür senkronizasyonu, PAO1’de LES faj replikasyonunun önemli aşamalarıyla ilişkili anahtar genetik belirteçlerin ekspresyon seviyelerini ölçmek için gerçek zamanlı PCR ile doğrulanabilir. Aynı yaklaşım daha önce Escherichia coli11,17,21,22’de motiliteyi, asit direncini ve antimikrobiyal direnci etkileyen Shiga-toksijenik fajların kehanet kısıtlı işlevlerini tanımlamak için kullanılmıştır.
E. coli MC106137,38,39’dan Stx fajının spontan indüksiyonunu daha doğru bir şekilde ölçmek için daha önce plak tahlillerinde kullanılan seçilebilir bir gösterge konağın oluşturulması, burada P. aeruginosa faj LESΦ2 için açıklanmıştır. Bu müdahale, numune işleme adımlarını ve süresini azaltma, böylece çoklu kültür koşullarında spontan indüksiyon oranlarının eşzamanlı olarak değerlendirilmesini sağlama avantajına sahiptir. Rifampisine dirençli varyantların(40) oluşturulması sırasında başka mutasyonlar üretme riski vardır; Bununla birlikte, bu çalışmada, evrimleşmiş suş yalnızca ilgilenilen kültürlerden alınan plakların sayımı için bir gösterge konakçı olarak kullanıldı ve transkriptomik analize dahil edilmedi. Seçilebilir indikatör suş, ilgilenilen faj tarafından enfeksiyona eşit derecede duyarlı kaldığı sürece, diğer edinilmiş mutasyonlar hakkında endişe yoktur. Bununla birlikte, PAO1WT ve PAO1RIF’in nabız alanı jel elektroforezi (PFGE) analizi ile kısıtlama fragmanı uzunluk polimorfizm profillerinde herhangi bir fark tespit edilmemiştir (veriler gösterilmemiştir).
Konakçı hücreleri seçerken, halihazırda kehanetleri barındırmayan bir gösterge suşu bulmak nadirdir. Bir örnek olarak, PAO1, ipliksi kehanet Pf4’ü barındırır. Bu çalışma için deneysel kontroller, spesifik fajların gen ekspresyonunu (bu durumda, LES prophage 2) ve bu fajın bakteriyel gen ekspresyonu üzerindeki etkilerini doğrudan inceleyebilmek için tasarlanmıştır. PAO1’den alınan transkriptlerin karşılaştırılmasında, LES kehaneti 2’yi taşıyan ve LES kehaneti 2’den yoksun (hem lizojen hem de lizojen olmayan, endojen Pf4’ü taşır), Pf4’ün konakçı üzerindeki etkisini dışlamak için dahili kontroller görevi görür. Ek olarak, Pf4’ün genellikle konakçı hücresinde41 lizise neden olmadığı ve bu nedenle bu deneylerin sonuçlarını karıştıramadığı gösterilmiştir.
Anlamlı omik veriler üretmek için numune hazırlamada dikkatli kalite kontrolünün çok önemli olduğu iyi bilinmektedir42. Bununla birlikte, daha önce tarif edildiği gibi,11, bu tür çalışmalar için lizojen kültürlerinin hazırlanmasında kehanet aktivitesinin dikkatli karakterizasyonu nadiren gerçekleştirilir. Burada, bakteriler ve ılıman fajlar arasındaki etkileşimleri daha iyi keşfetmek için transkriptomik çalışmalar için iyi kontrol edilen ve optimize edilmiş bir kültür seti hazırlamaya yönelik sistematik protokollerimizi detaylandırıyoruz. Popülasyonun eşzamanlılığı, indükleyici antibiyotik norfloksasin ile tedavi edilmeden önce kültürün en az dört katına çıkarılmasıyla kontrol edildi. Çalışmadaki suş için norfloksasin MİK’sini belirleyerek, indükleyici ajanın konsantrasyonunun “indüksiyon” tedavisi için MİK’nin hemen üzerinde olmasını sağlayabiliriz. Tedavi edilen hücreler daha sonra, hücrelerin faj replikasyon sürecini iyileştirmesine ve tamamlamasına izin vermek için 1 saatlik tedaviden sonra norfloksasin konsantrasyonunu MIC’nin altına düşürmek için 1:10 oranında seyreltildi, bu da hücrenin parçalanması ve enfektif faj soyunun serbest bırakılmasıyla sonuçlandı. Hücreler, indüksiyon uyaranını takiben litik replikasyon döngüsüne ancak iyileşme süresi boyunca norfloksasin konsantrasyonu MIC’nin altına getirildikten sonra girer. Bu durumda, 1 μg·mL−1 norfloksasinin üzerine çıkmak, PAO1 için norfloksasin için MIC 0.19 μg·mL−1 olduğundan, ilacın MIC’nin altında etkili bir şekilde seyreltilemeyeceği anlamına gelir. İndükleyici seyreltme seviyesi, lizojen geri kazanımı ihtiyacı ve RNA’nın toplanması için kültür yoğunluğunun korunması ile dengelenmelidir. Burada tartışılan veriler, lizojeninin baskın olduğu örnekler oluşturmak için kültürleri senkronize etmenin mümkün olduğunu, böylece spontan indüksiyondan kaynaklanan gürültüyü azaltmanın ve gen ekspresyonunda gerçek lizojeni kaynaklı değişikliklerin saptanmasını sağlamanın mümkün olduğunu göstermektedir. Lizojenik durum, bakteri hücre yoğunluğu düşük olduğunda büyümenin erken üstel fazında baskın olduğundan, RNA-Seq gibi sonraki gen ekspresyonu çalışmaları için yeterli RNA’yı toplamak için kültürlerin ölçeklendirilmesini öneriyoruz.
Kültürleri litik döngüye zorlamak için indükleyici bir ajan olarak norfloksasin kullanımı iyi bildirilmiştir43,44; Bununla birlikte, bu aynı zamanda süreçteki diğer bakteri genlerinin ekspresyonunu da etkileyecektir45,46. Bunu hafifletmek için, aynı indükleyici ve indükleyici olmayan koşullar altında yetiştirilen kontrol yabani tip kültürlerden elde edilen RNA kütüphaneleri, RNA-Seq deneylerine dahil edilmelidir. qRT-PCR ile faj replikasyonunun aşamalarını doğrulamak için dahili kontrollerin ve anahtar işaretleyici genlerin kullanılması da doğru karşılaştırmalar için çok önemlidir. Kantitatif RT-PCR profillemesi, çeşitli zaman noktalarında her gen için mutlak transkript sayılarının karşılaştırılmasıyla yorumlanamaz; Önemli olan profilin şeklidir. İlk olarak, herhangi bir gen için transkriptte sadece küçük bir bölge örneklenmiştir, bu nedenle kısa ömürlü mü yoksa daha uzun ömürlü bir element mi olduğu bilinmemektedir27. Kesinlikle, transkriptlerin RNA-Seq haritalaması, haritalama verilerinin yoğunluğunun bir genin uzunluğu boyunca önemli ölçüde değiştiğini göstermektedir. İkincisi, litik döngü veya lizojenik yaşam tarzı ile ilişkili veya hatta faj düzenleyici devrelerden ayrılmış bir belirteç gen için yorumlanması gereken gen ekspresyon profilinin şeklidir11. Spontan indüksiyon, lizojen kültüründe gerçek bir sorundur ve her zaman litik döngü ile ilişkili genlerin ekspresyonu ile sonuçlanacaktır. Bununla birlikte, profilleme, litik replikasyon döngüsü ile ilişkili genlerin, indüksiyon öncesi (en az iki log kıvrımı) ve indüksiyon sonrası yukarı regüle edilmelerinde bastırıldığını göstermektedir.
E. coli ile Stx faj etkileşimlerinin daha önce yapılan transkriptomik analizleri, lizojeninin korunmasında ve litik siklusun11,17 tetiklenmesinde rol oynayan faj genlerinin tam olarak anlaşılmasını desteklemektedir. Şu anda, P. aeruginosa’nın LES fajları açıklanmıştır, ancak anahtar gen işlevleri daha az anlaşılmıştır. Transkriptomik çalışmalar, LES kehanetlerinin yeniden açıklanmasını sağlayacak ve lizojeni ve litik döngüde yer alan genler hakkındaki anlayışımızı geliştirecektir. Gen dizisini işleve bağlamak, yeni kehanetlerin incelenmesinde büyük bir zorluğu temsil eder ve bu da daha iyi açıklama araçlarının üretimi için faj gen işlevlerini doğrulamak için daha fazla çalışmaya duyulan ihtiyacı daha da vurgular47. Bu video makalesinde ayrıntıları verilen protokollerin ve ekstra kalite kontrol önlemlerinin daha geniş bir şekilde uygulanması ve uyarlanması, çeşitli kehanet işlevlerinin ortaya çıkarılmasına ve böylece açıklama boru hatlarının iyileştirilmesine ve faj ve bakteri biyolojisi anlayışımızın dönüştürülmesine yardımcı olabilir.
PAO1 | 6 | ||
LESB58 | 6 | ||
LES phages | Induced and purified from LESB58 using Norfloxacin. | This study | |
Lysogeny Broth (LB) | Merck | 1.10285.500 | |
LB Agar | Merck | 1.10283.500 | |
Agar Agar | Fisher | A/1080/53 | |
Top Agar | 0.4 g Agar Agar+2.5 g LB Broth in 100 mL water; autoclave and use. | – | |
Rifampicin | Sigma (Stock: 50 mg/mL in Methanol- Mix well and use 0.22µm filter to sterilize and store it in -20°C until use) | R3501 | |
Glacial Acetic Acid | Fisher 1% (v/v) in water | 10060000 | |
Norfloxacin | Sigma (Stock: 25 mg/mL of 1% Glacial Acetic Acid-Mix well and use 0.22µm filter to sterilize and store it in -20°C until use;To avoid freeze thaw cycles, store as small aliquotes) | N9890 | |
Phenol saturated with citrate buffer pH 4.3 | Sigma | P-4682 | |
Molecular Biology grade Ethanol | Fisher | 16695992 | |
TRIzol | Invitrogen | 12044977 | |
Chloroform | Fisher | 11398187 | |
Isopropanol | Fisher | 17150576 | |
Nuclease-free H2O | Invitrogen | 10526945 | |
10X TURBO DNase | Ambion | AM1907 | |
Qubit RNA HS, BR Kit | Invitrogen | Q10210 | |
Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 | |
SuperScriptIII first strand synthesis kit | Invitrogen | 18080051 | |
PCR Reagents | Bioline Mytaq Red 2X | BIO-25043 | |
qPCR Reagents | Sensifast SYBR Hi Rox | BIO-92020 | |
PCR purification kit | Isolate II PCR and Gel Kit | BIO-52060 | |
TA cloning kit | TA Cloning Kit, with pCR 2.1 Vector, without competent cells | K202040 | |
StepOne Real Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4376600 |