Musmodeller kan vara användbara verktyg för att undersöka biologin hos retinalt pigmenterat epitel (RPE). Det har fastställts att möss kan utveckla en rad RPE-patologier. Här beskriver vi ett fenotypningsprotokoll för att belysa och kvantifiera RPE-patologier hos möss med hjälp av ljus, transmissionselektron och konfokalmikroskopi.
Åldersrelaterad makuladegeneration (AMD) är en försvagande retinal sjukdom hos åldrande befolkningar. Det anses allmänt att dysfunktion av retinal pigmenterat epitel (RPE) är en viktig patobiologisk händelse vid AMD. För att förstå mekanismerna som leder till RPE-dysfunktion kan musmodeller användas av forskare. Det har fastställts av tidigare studier att möss kan utveckla RPE-patologier, av vilka några observeras i ögonen på individer som diagnostiserats med AMD. Här beskriver vi ett fenotypningsprotokoll för att bedöma RPE-patologier hos möss. Detta protokoll innefattar beredning och utvärdering av retinala tvärsnitt med hjälp av ljusmikroskopi och transmissionselektronmikroskopi, liksom av RPE-plana fästen med konfokalmikroskopi. Vi beskriver de vanliga typerna av murina RPE-patologier som observeras av dessa tekniker och sätt att kvantifiera dem genom opartiska metoder för statistisk testning. Som bevis på konceptet använder vi detta RPE-fenotypningsprotokoll för att kvantifiera RPE-patologierna som observerats hos möss som överuttrycker transmembranprotein 135 (Tmem135) och åldrade vildtyp C57BL / 6J-möss. Huvudmålet med detta protokoll är att presentera standard RPE-fenotypningsmetoder med opartiska kvantitativa bedömningar för forskare som använder musmodeller av AMD.
Åldersrelaterad makuladegeneration (AMD) är en vanlig blindsjukdom som drabbar populationer över 55 år1. Många forskare tror att dysfunktion i retinalpigmenterat epitel (RPE) är en tidig och avgörande patobiologisk händelse i AMD2. RPE är ett monolager av polariserade celler som har till uppgift att upprätthålla homeostas hos närliggande fotoreceptorer och koroidala blodkärl3. En mängd olika modeller finns för att undersöka sjukdomsassocierade mekanismer inom RPE, inklusive cellodlingsmodeller 4,5 och möss 6,7,8. En ny rapport har beskrivit standardiserade protokoll och kvalitetskontrollkriterier för RPE-cellodlingsmodeller4, men ingen rapport har försökt standardisera fenotypningen av RPE i musmodeller. Faktum är att många publikationer om musmodeller av AMD saknar en fullständig beskrivning av RPE eller kvantifiering av RPE-patologierna i dem. Det övergripande målet med detta protokoll är att presentera standard RPE-fenotypningsmetoder med opartiska kvantitativa bedömningar för forskare som använder AMD-musmodeller.
Tidigare publikationer har noterat förekomsten av flera RPE-patologier hos möss genom tre avbildningstekniker. Till exempel tillåter ljusmikroskopi forskare att se den murina näthinnans grova morfologi (figur 1A) och upptäcka RPE-patologier som RPE-gallring, vakuolisering och migration. RPE-gallring i en AMD-musmodell exemplifieras av en avvikelse i RPE-höjden från deras respektive kontroller (figur 1B). RPE-vakuolisering kan delas in i två separata kategorier: mikrovakuolisering (figur 1C) och makrovakuolisering (figur 1D). RPE-mikrovakuolisering sammanfattas av närvaron av vakuoler i RPE som inte påverkar dess totala höjd, medan makrovakuolisering indikeras av närvaron av vakuoler som sticker ut i fotoreceptorernas yttre segment. RPE-migration kännetecknas av fokalaggregatet av pigment ovanför RPE-monolagret i ett retinalt tvärsnitt (figur 1E). Det bör noteras att migrerande RPE-celler i AMD-donatorögon uppvisar immunreaktivitet mot immuncellmarkörer, såsom kluster av differentiering 68 (CD68)9, och kan representera immunceller som uppslukar RPE-skräp eller RPE som genomgår transdifferentiering9. En annan bildteknik som kallas transmissionselektronmikroskopi kan tillåta forskare att visualisera ultrastrukturen hos RPE och dess basalmembran (figur 2A). Denna teknik kan identifiera den dominerande sub-RPE-avlagringen hos möss, känd som den basala laminära avlagringen (BLamD) (figur 2B)10. Slutligen kan konfokalmikroskopi avslöja RPE-cellernas struktur genom att avbilda RPE-plana fästen (figur 3A). Denna metod kan avslöja RPE-dysmorfi, avvikelsen från RPE från dess klassiska bikakeform (figur 3B). Det kan också detektera RPE-multinukleation, närvaron av tre eller flera kärnor i en RPE-cell (figur 3C). För en sammanfattning av de typer av RPE-patologier som finns i nuvarande AMD-musmodeller hänvisar vi forskare till dessa recensioner från litteraturen 6,7.
Forskare som studerar AMD bör vara medvetna om fördelarna och nackdelarna med att använda möss för att undersöka RPE-patologier före fenotypprotokollet. Möss är fördelaktiga på grund av deras relativt korta livslängd och kostnadseffektivitet, liksom deras genetiska och farmakologiska manipulerbarhet. Möss uppvisar också RPE-degenerativa förändringar, inklusive RPE-migration, dysmorfi och multinukleation, som observeras i AMD-donatorögon 11,12,13,14,15,16,17; Detta tyder på att liknande mekanismer kan ligga till grund för utvecklingen av dessa RPE-patologier hos möss och människor. Det finns dock viktiga skillnader som begränsar översättningsbarheten av musstudier till humant AMD. För det första har möss inte en makula, en anatomiskt distinkt region av den mänskliga näthinnan som är nödvändig för synskärpa som företrädesvis påverkas vid AMD. För det andra ses vissa RPE-patologier hos möss, som RPE-gallring och vakuolisering, vanligtvis inte i AMD-donatorögon18. För det tredje utvecklar möss inte drusen, ett kännetecken för AMD-patologi19. Drusen är lipid- och proteininnehållande avlagringar med mycket få basalmembranproteiner som bildas mellan RPE-basallamina och det inre kollagenskiktet i Bruchs membran (BrM)19. Drusen skiljer sig från BLamD, den vanliga sub-RPE-fyndigheten hos möss, både i deras sammansättning och anatomiska läge. BLamDs är ålders- och spänningsberoende extracellulära matrisberikade abnormiteter som bildas mellan RPE-basallamina i BrM och de basala invecklingarna i RPE20. Intressant nog har BLamDs en liknande proteinsammansättning och utseende hos både möss och människor 6,10,21. Nya arbeten tyder på att BLamDs kan verka i AMD: s patobiologi genom att påverka AMD: s progression till dess senare stadier18,22; Således kan dessa avlagringar representera sjuk RPE i musnäthinnan. Kunskap om dessa fördelar och begränsningar är avgörande för forskare som är intresserade av att översätta resultat från musstudier till AMD.
I detta protokoll diskuterar vi metoderna för att förbereda ögon för ljus, transmissionselektron och konfokalmikroskopi för att visualisera RPE-patologier. Vi beskriver också hur man kvantifierar RPE-patologier på ett opartiskt sätt för statistisk testning. Som bevis på konceptet använder vi RPE-fenotypningsprotokollet för att undersöka de strukturella RPE-patologierna som observerats i transmembranprotein 135- (Tmem135) överuttryckande möss och åldrade vildtyp (WT) C57BL / 6J-möss. Sammanfattningsvis strävar vi efter att beskriva fenotypningsmetoden för att karakterisera RPE i AMD-musmodeller, eftersom det för närvarande inte finns några standardprotokoll tillgängliga. Forskare som är intresserade av att undersöka och kvantifiera patologier hos fotoreceptorerna eller choroid, som också påverkas i AMD-musmodeller, kanske inte tycker att detta protokoll är användbart för sina studier.
I den här artikeln introducerade vi ett fenotypprotokoll för att bedöma de strukturella RPE-patologierna hos musmodeller. Vi beskrev de steg som krävs för att bearbeta ögonen för olika avbildningstekniker inklusive ljus, transmissionselektron och konfokalmikroskopi, samt kvantifiering av typiska patologier observerade via dessa avbildningsmetoder. Vi bevisade effektiviteten av vårt RPE-fenotypningsprotokoll genom att undersöka Tmem135 TG och 24 månader gamla WT-möss, eftersom dessa möss visa…
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill erkänna Satoshi Kinoshita och University of Wisconsin (UW) Translational Research Initiatives in Pathology laboratory (TRIP) för att förbereda våra vävnader för ljusmikroskopi. Denna kärna stöds av UW Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Wisconsin Carbone Cancer Center (P30 CA014520) och Office of The Director-NIH (S10OD023526). Konfokalmikroskopi utfördes vid UW Biochemistry Optical Core, som etablerades med stöd från UW Department of Biochemistry Endowment. Detta arbete stöddes också av bidrag från National Eye Institute (R01EY022086 till A. Ikeda; R01EY031748 till C. Bowes Rickman; P30EY016665 till Institutionen för oftalmologi och visuella vetenskaper vid UW; P30EY005722 till Duke Eye Center; NIH T32EY027721 till M. Landowski; F32EY032766 till M. Landowski), Timothy William Trout ordförandeskap (A. Ikeda), FFB Free Family AMD Award (C. Bowes Rickman); och ett obegränsat bidrag från Research to Prevent Blindness (Duke Eye Center).
0.1 M Cacodylate Buffer pH7.2 | PolyScientiifc R&D Company | S1619 | |
100 Capacity Slide Box | Two are needed for this protocol (one for H&E-stained slides and one for RPE flat mounts.) | ||
100% Ethanol | MDS Warehouse | 2292-CASE | Can be used to make diluted ethanol solutions in this protocol. |
1-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks | Qosina | 11069 | |
1x Phosphate Buffer Solution (PBS) | Premade 1x PBS can be used in this protocol. | ||
2.0 mL microtubes | Genesee Scientific | 24-283-LR | |
24 Cavity Embedding Capsule Substitute Mold | Electron Microscopy Sciences | 70165 | |
24 inch PVC Tubing with Luer Ends | Fisher Scientific | NC1376778 | |
400 Mesh Gilder Thin Bar Square Mesh Grids | Electron Microscopy Sciences | T400-Cu | |
95% Ethanol | MDS Warehouse | 2293-CASE | |
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier (23 inches by 24 inches) | VWR | 56616-031 | |
Adjustable 237 ml Spray Bottle | VWR | 23609-182 | |
Alexa Fluor488 Conjugated Donkey anti-Rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | |
Aluminum Foil | |||
BD Precision glide 19 Gauge Syringe Needle | Sigma-Aldrich | Z192546 | |
Bracken Forceps; Curved; Fine Cross Serrations; 4" Length, 1 mm Tip Width | Roboz Surgical Instrument | RS-5211 | Known as curved forceps in this protocol. |
Camel Hair Brush | Electron Microscopy Sciences | 65575-02 | |
Carbon Dioxide Euthanasia Chamber | |||
Carbon Dioxide Flow Meter | |||
Carbon Dioxide Tank | |||
Castaloy Prong Extension Clamps | Fisher Scientific | 05-769-7Q | |
Cast-Iron L-shaped Base Support Stand | Fisher Scientific | 11-474-207 | |
Cell Prolifer Program | Available to download: https://cellprofiler.org/releases | ||
Clear Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
Colorfrost Microscope Slides Lavender | VWR | 10118-956 | |
Computer | |||
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-5MG | |
Distilled H20 | Water from Milli-Q Purification System was used in this protocol. | ||
Dumont Thin Tip Tweezers; Pattern #55 | Roboz Surgical Instrument | RS-4984 | Known as fine-tipped forceps in this protocol, and 3 are needed for this protocol (two for dissections and one for electron microscope processing). |
Electron Microscopy Grid Holder | Electron Microscopy Sciences | 71147-01 | |
EPON 815 Resin | Electron Microscopy Sciences | 14910 | |
Epredia Mark-It Tissue Marking Yellow Dye | Fisher Scientific | 22050460 | Please follow manufacturer's protocol when using this tissue marking dye. |
Epredia Mounting Media | Fisher Scientific | 22-110-610 | Use for mounting H&E slides. |
Fiber-Lite Mi-150 Illuminator Series,150 w Halogen Light Source | Dolan-Jenner Industries | Mi-150 | Light source for dissecting microscope. |
Fiji ImageJ Program | Available to download: https://imagej.net/downloads | ||
Flexaframe Castaloy Hook Connector | Thermo Scientific | 14-666-18Q | |
Fume hood | |||
Glutaraldehyde 2.5% in Phosphate Buffer, pH 7.4, 32% | Electron Microscopy Sciences | 16537-05 | |
JEM-1400 Transmission Electron Microscope (JEOL) with an ORIUS (1000) CCD Camera | |||
Laboratory Benchtop Shaker | Two are needed for these experiments. One should be at room temperature while the other should be in a 4 degree Celsius cold room. | ||
Laser Cryo Tag Labels | Electron Microscopy Sciences | 77564-05 | |
Lead Citrate | Electron Microscopy Sciences | 17800 | |
Leica EM UC7Ultramicrotome | |||
Leica Reichert Ultracut S Microtome | |||
LifterSlips | Thermo Fisher Scientific | 22X22I24788001LS | Use these coverslips for the RPE flat mounts as they have raised edges and accommodate the thickness of the RPE. |
Mayer's Hematoxylin | VWR | 100504-406 | |
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5600 | Known as micro-dissecting scissors in protocol. |
Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
Mice | Any AMD mouse model and its respective controls can work for this protocol. | ||
Micro Dissecting Scissors; Standard Version; Curved; Sharp Points; 24 mm Blade Length; 4.5" Overall Length | Roboz Surgical Instrument | RS-5913 | Known as curved scissors in this protocol. |
Microsoft Excel | |||
Microtube racks | |||
Nikon A1RS Confocal Microscope | |||
Normal Donkey Serum | SouthernBiotech | 0030-01 | |
Number 11 Sterile Disposable Scalpel Blades | VWR | 21909-380 | |
Osmium Tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19150 | |
Paraformaldehyde, 32% | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
Pencil | |||
Petri Dish | VWR | 21909-380 | |
Pipette Tips | |||
Pipettes | |||
Polyclonal Anti-ZO-1 Antibody | Thermo Fisher Scientific | 402200 | |
Propylene Oxide | Electron Microscopy Sciences | 20412 | |
Razor Blade | VWR | 10040-386 | |
Shallow Tray for Mouse Perfusions | |||
Shandon Eosin Y Alcoholic | VWR | 89370-828 | |
Sharpie Ultra Fine Tip Black Permanent Marker | Staples | 642736 | |
Slide Rack for Staining | Grainger | 49WF31 | |
Squared Cover Glass Slips | Fisher Scientific | 12-541B | |
Staining Dish with Cover | Grainger | 49WF30 | Need 15 for H&E staining procedure. |
Target All-Plastic Disposable Luer-Slip 50 mL Syringe | Thermo Scientific | S7510-50 | Use only the syringe barrel. |
Timer | Fisher | 1464917 | |
Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | |
Vacuum Oven | |||
Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | Use for mounting RPE flat mounts. |
Xylene | Fisher Scientific | 22050283 | |
Zeiss Axio Imager 2 Light Microscope | This microscope has the capacity to generate stitched 20x images. If a light microscope does not have this capacity, then take images of the entire retina that are slightly overlapping each other. Use Adobe Photoshop to stitch these images together. Please refer to the manuals of the Adobe Photoshop program for image stitching. | ||
Zeiss Stemi 2000 Dissecting Microscope | Electron Microscopy Sciences | 65575-02 |