Protocole d’évaluation et de quantification des pathologies de l’épithélium pigmenté rétinien dans des modèles murins de dégénérescence maculaire liée à l’âge

La dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) est une maladie cécitante courante qui touche les populations de plus de 55 ans¹. De nombreux chercheurs pensent que le dysfonctionnement de l’épithélium pigmenté rétinien (EPR) est un événement pathobiologique précoce et crucial dans la DMLA². L’EPR est une monocouche de cellules polarisées chargée de maintenir l’homéostasie des photorécepteurs voisins et des vaisseaux sanguins choroïdiens³. Il existe divers modèles pour étudier les mécanismes associés à la maladie au sein de l’EPR, y compris les modèles de culture cellulaire ^4,5 et les souris 6,7,8. Un rapport récent a décrit des protocoles normalisés et des critères de contrôle de la qualité pour les modèles de culture cellulaire EPR⁴, mais aucun rapport n’a tenté de normaliser le phénotypage de l’EPR dans les modèles murins. En fait, de nombreuses publications sur des modèles murins de DMLA manquent d’une description complète de l’EPR ou d’une quantification des pathologies de l’EPR qu’ils contiennent. L’objectif global de ce protocole est de présenter des méthodes de phénotypage RPE standard avec des évaluations quantitatives non biaisées pour les scientifiques utilisant des modèles murins AMD.

Des publications antérieures ont noté la présence de plusieurs pathologies RPE chez la souris grâce à trois techniques d’imagerie. Par exemple, la microscopie optique permet aux chercheurs de visualiser la morphologie grossière de la rétine murine (Figure 1A) et de détecter des pathologies de l’EPR telles que l’amincissement de l’EPR, la vacuolisation et la migration. L’amincissement de l’EPR dans un modèle murin AMD est illustré par un écart de la hauteur de l’EPR par rapport à leurs contrôles respectifs (Figure 1B). La vacuolisation de l’EPR peut être divisée en deux catégories distinctes : la microvacuolisation (figure 1C) et la macrovacuolisation (figure 1D). La microvacuolisation de l’EPR est résumée par la présence de vacuoles dans l’EPR qui n’affectent pas sa hauteur totale, tandis que la macrovacuolisation est indiquée par la présence de vacuoles qui font saillie dans les segments externes des photorécepteurs. La migration de l’EPR se distingue par l’agrégat focal de pigment au-dessus de la monocouche de l’EPR dans une section transversale rétinienne (Figure 1E). Il convient de noter que les cellules EPR migratrices dans les yeux des donneurs de DMLA présentent une immunoréactivité aux marqueurs des cellules immunitaires, tels que le groupe de différenciation 68 (CD68)9, et pourraient représenter des cellules immunitaires engloutissant des débris d’EPR ou des EPR subissant une transdifférenciation ⁹. Une autre technique d’imagerie appelée microscopie électronique à transmission peut permettre aux chercheurs de visualiser l’ultrastructure de l’EPR et de sa membrane basale (Figure 2A). Cette technique permet d’identifier le dépôt sous-RPE prédominant chez la souris, connu sous le nom de dépôt laminaire basal (BLamD) (Figure 2B)¹⁰. Enfin, la microscopie confocale peut révéler la structure des cellules EPR grâce à l’imagerie des supports plats de l’EPR (Figure 3A). Cette méthode permet de découvrir la dysmorphie de l’EPR, c’est-à-dire la déviation de l’EPR par rapport à sa forme classique en nid d’abeille (Figure 3B). Il peut également détecter la multinucléation de l’EPR, la présence de trois noyaux ou plus dans une cellule EPR (Figure 3C). Pour un résumé des types de pathologies RPE présentes dans les modèles murins DMLA actuels, nous renvoyons les chercheurs à ces revues de la littérature ^6,7.

Les chercheurs qui étudient la DMLA devraient être conscients des avantages et des inconvénients de l’utilisation de souris pour étudier les pathologies de l’EPR avant le protocole de phénotypage. Les souris sont avantageuses en raison de leur durée de vie relativement courte et de leur rentabilité, ainsi que de leur manipulabilité génétique et pharmacologique. Les souris présentent également des changements dégénératifs de l’EPR, y compris la migration de l’EPR, la dysmorphie et la multinucléation, qui sont observés dans les yeux des donneurs de DMLA 11,12,13,14,15,16,17; cela suggère que des mécanismes similaires peuvent sous-tendre le développement de ces pathologies RPE chez la souris et l’homme. Cependant, il existe des différences clés qui limitent la transposabilité des études sur les souris à la DMLA humaine. Premièrement, les souris n’ont pas de macula, une région anatomiquement distincte de la rétine humaine nécessaire à l’acuité visuelle qui est préférentiellement affectée dans la DMLA. Deuxièmement, certaines pathologies de l’EPR chez la souris, comme l’amincissement et la vacuolisation de l’EPR, ne sont généralement pas observées dans les yeux des donneurs de DMLA¹⁸. Troisièmement, les souris ne développent pas de drusen, une caractéristique de la pathologie DMLA¹⁹. Les Drusen sont des dépôts contenant des lipides et des protéines avec très peu de protéines de la membrane basale qui se forment entre la lame basale RPE et la couche collagène interne de la membrane de Bruch (BrM)¹⁹. Drusen diffère de BLamD, le dépôt sous-RPE commun chez la souris, à la fois dans sa composition et sa localisation anatomique. Les BLamD sont des anomalies enrichies par la matrice extracellulaire dépendantes de l’âge et du stress qui se forment entre la lame basale RPE de BrM et les repliements basaux du RPE²⁰. Fait intéressant, les BLamD ont une composition protéique et une apparence similaires chez les souris et les humains ^6,10,21. Des travaux récents suggèrent que les BLamD peuvent agir dans la pathobiologie de la DMLA en influençant la progression de la DMLA vers ses stades ultérieurs^18,22 ; ainsi, ces dépôts peuvent représenter un EPR malade dans la rétine de la souris. La connaissance de ces avantages et limites est essentielle pour les chercheurs intéressés à traduire les résultats d’études sur la souris à la DMLA.

Dans ce protocole, nous discutons des méthodes de préparation des yeux à la lumière, à l’électron de transmission et à la microscopie confocale pour visualiser les pathologies de l’EPR. Nous décrivons également comment quantifier les pathologies de l’EPR de manière impartiale pour les tests statistiques. Comme preuve de concept, nous utilisons le protocole de phénotypage RPE pour étudier les pathologies structurelles de l’EPR observées chez les souris surexprimant la protéine transmembranaire 135- (Tmem135) et les souris âgées de type sauvage (WT) C57BL/6J. En résumé, nous visons à décrire la méthodologie de phénotypage pour caractériser l’EPR dans les modèles murins AMD, car il n’existe actuellement aucun protocole standard disponible. Les chercheurs intéressés par l’examen et la quantification des pathologies des photorécepteurs ou des choroïdes, qui sont également affectées dans les modèles murins DMLA, peuvent ne pas trouver ce protocole utile pour leurs études.