Un protocolo para evaluar y cuantificar patologías del epitelio pigmentado retiniano en modelos murinos de degeneración macular relacionada con la edad

La degeneración macular asociada a la edad (DMAE) es una enfermedad ceguera común que afecta a poblaciones mayores de 55 años¹. Muchos investigadores creen que la disfunción dentro del epitelio pigmentado de la retina (EPR) es un evento patobiológico temprano y crucial en la DMAE². El EPR es una monocapa de células polarizadas encargadas de mantener la homeostasis de los fotorreceptores vecinos y los vasos sanguíneos coroideos³. Existe una variedad de modelos para investigar los mecanismos asociados a la enfermedad dentro del EPR, incluidos los modelos de cultivo celular ^4,5 y los ratones 6,7,8. Un informe reciente ha descrito protocolos estandarizados y criterios de control de calidad para modelos de cultivo celular de EPR⁴, sin embargo, ningún informe ha intentado estandarizar el fenotipado del EPR en modelos de ratón. De hecho, muchas publicaciones sobre modelos de ratón de DMAE carecen de una descripción completa del EPR o cuantificación de las patologías del EPR en ellos. El objetivo general de este protocolo es presentar métodos estándar de fenotipado de EPR con evaluaciones cuantitativas imparciales para científicos que utilizan modelos de ratón DMAE.

Publicaciones anteriores han observado la presencia de varias patologías del EPR en ratones a través de tres técnicas de imagen. Por ejemplo, la microscopía óptica permite a los investigadores ver la morfología macroscópica de la retina murina (Figura 1A) y detectar patologías del EPR como el adelgazamiento, la vacuolización y la migración del EPR. El adelgazamiento del EPR en un modelo de ratón AMD se ejemplifica mediante una desviación en la altura del EPR de sus respectivos controles (Figura 1B). La vacuolización del EPR se puede dividir en dos categorías separadas: microvacuolización (Figura 1C) y macrovacuolización (Figura 1D). La microvacuolización del EPR se resume en la presencia de vacuolas en el EPR que no afectan su altura total, mientras que la macrovacuolización está indicada por la presencia de vacuolas que sobresalen en los segmentos externos de los fotorreceptores. La migración del EPR se distingue por el agregado focal de pigmento por encima de la monocapa del EPR en una sección transversal retiniana (Figura 1E). Cabe señalar que las células migratorias del EPR en los ojos de los donantes de DMAE exhiben inmunorreactividad a los marcadores de células inmunitarias, como el grupo de diferenciación 68 (CD68)9, y podrían representar células inmunitarias que envuelven restos de EPR o EPR en transdiferenciación⁹. Otra técnica de imagen llamada microscopía electrónica de transmisión puede permitir a los investigadores visualizar la ultraestructura del EPR y su membrana basal (Figura 2A). Esta técnica puede identificar el depósito sub-EPR predominante en ratones, conocido como depósito laminar basal (BLamD) (Figura 2B)¹⁰. Por último, la microscopía confocal puede revelar la estructura de las células del EPR a través de montajes planos de imágenes del EPR (Figura 3A). Este método puede descubrir la dismorfia del EPR, la desviación del EPR de su forma clásica de panal (Figura 3B). También puede detectar la multinucleación del EPR, la presencia de tres o más núcleos dentro de una célula del EPR (Figura 3C). Para un resumen de los tipos de patologías del EPR presentes en los modelos actuales de ratón DMAE, remitimos a los investigadores a estas revisiones de la literatura ^6,7.

Los investigadores que estudian la DMAE deben ser conscientes de las ventajas y desventajas de usar ratones para investigar patologías RPE antes del protocolo de fenotipado. Los ratones son ventajosos debido a su vida relativamente corta y rentabilidad, así como a su manipulabilidad genética y farmacológica. Los ratones también exhiben cambios degenerativos del EPR, incluyendo migración del EPR, dismorfia y multinucleación, que se observan en los ojos de los donantes de DMAE 11,12,13,14,15,16,17; esto sugiere que mecanismos similares pueden subyacer al desarrollo de estas patologías del EPR en ratones y humanos. Sin embargo, existen diferencias clave que limitan la traducibilidad de los estudios con ratones a la DMAE humana. Primero, los ratones no tienen una mácula, una región anatómicamente distinta de la retina humana necesaria para la agudeza visual que se ve afectada preferentemente en la DMAE. En segundo lugar, algunas patologías del EPR en ratones, como el adelgazamiento del EPR y la vacuolización, no se observan típicamente en los ojos de los donantes de DMAE¹⁸. En tercer lugar, los ratones no desarrollan drusas, un sello distintivo de la patología de la DMAE¹⁹. Las drusas son depósitos que contienen lípidos y proteínas con muy pocas proteínas de la membrana basal que se forman entre la lámina basal del EPR y la capa colágena interna de la membrana de Bruch (BrM)¹⁹. Las drusas difieren de BLamD, el depósito común de sub-RPE en ratones, tanto en su composición como en su ubicación anatómica. Los BLamD son anomalías enriquecidas con matriz extracelular dependientes de la edad y el estrés que se forman entre la lámina basal del EPR de BrM y los pliegues basales del EPR²⁰. Curiosamente, los BLamD tienen una composición y apariencia de proteínas similares tanto en ratones como en humanos ^6,10,21. Trabajos recientes sugieren que los BLamD pueden actuar en la patobiología de la DMAE al influir en la progresión de la DMAE a sus etapas posteriores^18,22; por lo tanto, estos depósitos pueden representar EPR enfermo en la retina del ratón. El conocimiento de estos beneficios y limitaciones es fundamental para los investigadores interesados en traducir los resultados de los estudios con ratones a la DMAE.

En este protocolo, discutimos los métodos para preparar los ojos para la luz, el electrón de transmisión y la microscopía confocal para visualizar patologías de EPR. También describimos cómo cuantificar las patologías del EPR de manera imparcial para las pruebas estadísticas. Como prueba de concepto, utilizamos el protocolo de fenotipado de EPR para investigar las patologías estructurales del EPR observadas en ratones que sobreexpresan la proteína transmembrana 135- (Tmem135) y ratones envejecidos tipo salvaje (WT) C57BL / 6J. En resumen, nuestro objetivo es describir la metodología de fenotipado para caracterizar el EPR en modelos de ratón DMAE, ya que actualmente no hay protocolos estándar disponibles. Los investigadores interesados en examinar y cuantificar patologías de los fotorreceptores o coroides, que también se ven afectados en modelos de ratón DMAE, pueden no encontrar este protocolo útil para sus estudios.