माउस मॉडल रेटिना पिगमेंटेड एपिथेलियम (आरपीई) के जीव विज्ञान की जांच के लिए उपयोगी उपकरण हो सकते हैं। यह स्थापित किया गया है कि चूहे आरपीई विकृति की एक सरणी विकसित कर सकते हैं। यहां, हम प्रकाश, संचरण इलेक्ट्रॉन और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके चूहों में आरपीई विकृति को स्पष्ट करने और निर्धारित करने के लिए एक फेनोटाइपिंग प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।
उम्र से संबंधित मैकुलर अपघटन (एएमडी) उम्र बढ़ने वाली आबादी में एक दुर्बल रेटिना विकार है। यह व्यापक रूप से माना जाता है कि रेटिना पिगमेंटेड एपिथेलियम (आरपीई) की शिथिलता एएमडी में एक महत्वपूर्ण पैथोबायोलॉजिकल घटना है। आरपीई डिसफंक्शन का कारण बनने वाले तंत्र को समझने के लिए, शोधकर्ताओं द्वारा माउस मॉडल का उपयोग किया जा सकता है। यह पिछले अध्ययनों द्वारा स्थापित किया गया है कि चूहे आरपीई विकृति विकसित कर सकते हैं, जिनमें से कुछ एएमडी के निदान वाले व्यक्तियों की आंखों में देखे जाते हैं। यहां, हम चूहों में आरपीई विकृति का आकलन करने के लिए एक फेनोटाइपिंग प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। इस प्रोटोकॉल में प्रकाश माइक्रोस्कोपी और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके रेटिना क्रॉस-सेक्शन की तैयारी और मूल्यांकन शामिल है, साथ ही कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा आरपीई फ्लैट माउंट भी शामिल हैं। हम इन तकनीकों द्वारा देखे गए सामान्य प्रकार के मुराइन आरपीई विकृति और सांख्यिकीय परीक्षण के लिए निष्पक्ष तरीकों के माध्यम से उन्हें निर्धारित करने के तरीकों का विस्तार करते हैं। अवधारणा के प्रमाण के रूप में, हम इस आरपीई फेनोटाइपिंग प्रोटोकॉल का उपयोग चूहों में देखे गए आरपीई विकृति को मापने के लिए करते हैं जो ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन 135 (Tmem135) और वृद्ध जंगली-प्रकार C57BL / 6J चूहों को अतिरंजित करते हैं। इस प्रोटोकॉल का मुख्य लक्ष्य एएमडी के माउस मॉडल का उपयोग करने वाले वैज्ञानिकों के लिए निष्पक्ष मात्रात्मक आकलन के साथ मानक आरपीई फेनोटाइपिंग विधियों को प्रस्तुत करना है।
उम्र से संबंधित मैकुलर अपघटन (एएमडी) एक आम अंधा बीमारी है जो 55 1 वर्ष से अधिक उम्र की आबादी को प्रभावित करतीहै। कई शोधकर्ताओं का मानना है कि रेटिना पिगमेंटेड एपिथेलियम (आरपीई) के भीतर शिथिलता एएमडी2 में एक प्रारंभिक और महत्वपूर्ण पैथोबायोलॉजिकल घटना है। आरपीई ध्रुवीकृत कोशिकाओं का एक मोनोलेयर है जिसे पड़ोसी फोटोरिसेप्टर और कोरॉयडल रक्त वाहिकाओंके होमियोस्टैसिस को बनाए रखने का काम सौंपा गया है। आरपीई के भीतर रोग से जुड़े तंत्र की जांच करने के लिए विभिन्न प्रकार के मॉडल मौजूद हैं, जिनमें सेल कल्चर मॉडल 4,5 और चूहे 6,7,8 शामिल हैं। एक हालिया रिपोर्ट ने आरपीई सेल कल्चर मॉडल4 के लिए मानकीकृत प्रोटोकॉल और गुणवत्ता नियंत्रण मानदंडों का वर्णन किया है, फिर भी किसी भी रिपोर्ट ने माउस मॉडल में आरपीई के फेनोटाइपिंग को मानकीकृत करने का प्रयास नहीं किया है। वास्तव में, एएमडी के माउस मॉडल पर कई प्रकाशनों में आरपीई का पूरा विवरण या उनमें आरपीई विकृति का परिमाणीकरण नहीं है। इस प्रोटोकॉल का समग्र लक्ष्य एएमडी माउस मॉडल का उपयोग करने वाले वैज्ञानिकों के लिए निष्पक्ष मात्रात्मक आकलन के साथ मानक आरपीई फेनोटाइपिंग विधियों को प्रस्तुत करना है।
पिछले प्रकाशनों ने तीन इमेजिंग तकनीकों के माध्यम से चूहों में कई आरपीई विकृति की उपस्थिति का उल्लेख किया है। उदाहरण के लिए, प्रकाश माइक्रोस्कोपी शोधकर्ताओं को मुराइन रेटिना (चित्रा 1 ए) की सकल आकृति विज्ञान को देखने और आरपीई विकृति जैसे आरपीई पतलापन, रिक्तीकरण और प्रवासन का पता लगाने की अनुमति देता है। एएमडी माउस मॉडल में आरपीई पतलेपन को उनके संबंधित नियंत्रणों (चित्रा 1 बी) से आरपीई ऊंचाई में विचलन द्वारा उदाहरण दिया जाता है। आरपीई वैक्यूलाइजेशन को दो अलग-अलग श्रेणियों में विभाजित किया जा सकता है: माइक्रोवैक्यूलाइजेशन (चित्रा 1 सी) और मैक्रोवैक्यूलाइजेशन (चित्रा 1 डी)। आरपीई माइक्रोवैक्यूलाइजेशन को आरपीई में रिक्तिकाओं की उपस्थिति से संक्षेपित किया जाता है जो इसकी समग्र ऊंचाई को प्रभावित नहीं करते हैं, जबकि मैक्रोवैक्यूलाइजेशन को रिक्तिकाओं की उपस्थिति से इंगित किया जाता है जो फोटोरिसेप्टर के बाहरी खंडों में फैलते हैं। आरपीई माइग्रेशन को रेटिना क्रॉस-सेक्शन (चित्रा 1 ई) में आरपीई मोनोलेयर के ऊपर वर्णक के फोकल एग्रीगेट द्वारा प्रतिष्ठित किया जाता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एएमडी दाता आंखों में प्रवासी आरपीई कोशिकाएं प्रतिरक्षा कोशिका मार्करों के लिए विकृति प्रदर्शित करती हैं, जैसे कि भेदभाव 68 (सीडी 68)9 का समूह, और आरपीई मलबे या आरपीई को घेरने वाली प्रतिरक्षा कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व कर सकताहै। ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी नामक एक और इमेजिंग तकनीक शोधकर्ताओं को आरपीई और उसके तहखाने झिल्ली (चित्रा 2 ए) की अल्ट्रास्ट्रक्चर की कल्पना करने की अनुमति दे सकती है। यह तकनीक चूहों में प्रमुख उप-आरपीई जमा की पहचान कर सकती है, जिसे बेसल लैमिनर डिपॉजिट (बीएलएएमडी) (चित्रा 2 बी)10 के रूप में जाना जाता है। अंत में, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी इमेजिंग आरपीई फ्लैट माउंट (चित्रा 3 ए) के माध्यम से आरपीई कोशिकाओं की संरचना को प्रकट कर सकती है। यह विधि आरपीई डिस्मॉर्फिया को उजागर कर सकती है, अपने क्लासिक हनीकॉम्ब आकार (चित्रा 3 बी) से आरपीई का विचलन। यह आरपीई मल्टीन्यूक्लियेशन का भी पता लगा सकता है, एक आरपीई सेल के भीतर तीन या अधिक नाभिक की उपस्थिति (चित्रा 3 सी)। वर्तमान एएमडी माउस मॉडल में मौजूद आरपीई विकृति के प्रकारों के सारांश के लिए, हम शोधकर्ताओं को साहित्य 6,7 से इन समीक्षाओं के लिए संदर्भित करते हैं।
एएमडी का अध्ययन करने वाले शोधकर्ताओं को फेनोटाइपिंग प्रोटोकॉल से पहले आरपीई विकृति की जांच करने के लिए चूहों का उपयोग करने के फायदे और नुकसान के बारे में पता होना चाहिए। चूहे अपने अपेक्षाकृत कम जीवन काल और लागत-प्रभावशीलता के साथ-साथ उनके आनुवंशिक और फार्माकोलॉजिकल मैनिपुलेबिलिटी के कारण फायदेमंद हैं। चूहे आरपीई अपक्षयी परिवर्तनों को भी प्रदर्शित करते हैं, जिसमें आरपीई माइग्रेशन, डिस्मोर्फिया और मल्टीन्यूक्लियेशन शामिल हैं, जो एएमडी दाता आंखों 11,12,13,14,15,16,17 में देखे जाते हैं; इससे पता चलता है कि इसी तरह के तंत्र चूहों और मनुष्यों में इन आरपीई विकृति के विकास को कम कर सकते हैं। हालांकि, महत्वपूर्ण अंतर हैं जो मानव एएमडी के लिए माउस अध्ययन की हस्तांतरणीयता को सीमित करते हैं। सबसे पहले, चूहों में एक मैक्युला नहीं होता है, जो दृश्य तीक्ष्णता के लिए आवश्यक मानव रेटिना का एक शारीरिक रूप से अलग क्षेत्र है जो एएमडी में अधिमानतः प्रभावित होता है। दूसरा, चूहों में कुछ आरपीई विकृति, जैसे आरपीई पतला होना और वैक्यूलाइजेशन, आमतौर पर एएमडीदाता आंखों में नहीं देखा जाता है। तीसरा, चूहों में ड्रूसन विकसित नहीं होता है, जो एएमडी पैथोलॉजी19 की एक पहचान है। ड्रुसेन लिपिड- और प्रोटीन युक्त जमा होते हैं जिनमें बहुत कम तहखाने झिल्ली प्रोटीन होते हैं जो आरपीई बेसल लैमिना और ब्रुच की झिल्ली (बीआरएम) 19 की आंतरिक कोलेजनस परत के बीच बनते हैं। ड्रुसेन उनकी संरचना और शारीरिक स्थान दोनों में चूहों में सामान्य उप-आरपीई जमा, बीएलएमडी से भिन्न होता है। बीएलएएमडी उम्र और तनाव-निर्भर बाह्य मैट्रिक्स-समृद्ध असामान्यताएं हैं जो बीआरएम के आरपीई बेसल लैमिना और आरपीई20 के बेसल इनफोल्डिंग के बीच बनती हैं। दिलचस्प बात यह है कि बीएलएएमडी में चूहों और मनुष्यों दोनों में एक समान प्रोटीन संरचना और उपस्थिति 6,10,21 है। हाल के काम से पता चलता है कि बीएलएएमडी एएमडी की प्रगति को इसके बाद के चरणों18,22 तक प्रभावित करके एएमडी के पैथोबायोलॉजी में कार्य कर सकते हैं; इस प्रकार, ये जमा माउस रेटिना में रोगग्रस्त आरपीई का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं। माउस अध्ययन से एएमडी में परिणामों का अनुवाद करने में रुचि रखने वाले शोधकर्ताओं के लिए इन लाभों और सीमाओं का ज्ञान महत्वपूर्ण है।
इस प्रोटोकॉल में, हम आरपीई विकृति की कल्पना करने के लिए प्रकाश, संचरण इलेक्ट्रॉन और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए आंखों को तैयार करने के तरीकों पर चर्चा करते हैं। हम यह भी वर्णन करते हैं कि सांख्यिकीय परीक्षण के लिए निष्पक्ष तरीके से आरपीई विकृति की मात्रा कैसे निर्धारित की जाए। अवधारणा के प्रमाण के रूप में, हम चूहों और वृद्ध जंगली-प्रकार (डब्ल्यूटी) सी 57बीएल / 6 जे चूहों को अतिरंजित करने वाले ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन 135- (टीएमईएम 135) में देखे गए संरचनात्मक आरपीई विकृति की जांच करने के लिए आरपीई फेनोटाइपिंग प्रोटोकॉल का उपयोग करते हैं। सारांश में, हम एएमडी माउस मॉडल में आरपीई को चिह्नित करने के लिए फेनोटाइपिंग पद्धति का वर्णन करना चाहते हैं, क्योंकि वर्तमान में कोई मानक प्रोटोकॉल उपलब्ध नहीं हैं। फोटोरिसेप्टर या कोरॉइड के विकृति की जांच और मात्रा निर्धारित करने में रुचि रखने वाले शोधकर्ता, जो एएमडी माउस मॉडल में भी प्रभावित होते हैं, इस प्रोटोकॉल को उनके अध्ययन के लिए उपयोगी नहीं पा सकते हैं।
इस लेख में, हमने माउस मॉडल के संरचनात्मक आरपीई विकृति का आकलन करने के लिए एक फेनोटाइपिंग प्रोटोकॉल पेश किया। हमने प्रकाश, संचरण इलेक्ट्रॉन और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी सहित विभिन्न इमेजिंग तकनीकों के ल…
The authors have nothing to disclose.
लेखक प्रकाश माइक्रोस्कोपी के लिए हमारे ऊतकों को तैयार करने के लिए पैथोलॉजी प्रयोगशाला (ट्रिप) में सतोशी किनोशिता और विस्कॉन्सिन विश्वविद्यालय (यूडब्ल्यू) ट्रांसलेशनल रिसर्च इनिशिएटिव्स को स्वीकार करना चाहते हैं। यह कोर यूडब्ल्यू डिपार्टमेंट ऑफ पैथोलॉजी एंड लेबोरेटरी मेडिसिन, विस्कॉन्सिन यूनिवर्सिटी कारबोन कैंसर सेंटर (पी 30 सीए 014520), और निदेशक-एनआईएच (एस 10 ओडी023526) के कार्यालय द्वारा समर्थित है। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी यूडब्ल्यू बायोकैमिस्ट्री ऑप्टिकल कोर में किया गया था, जिसे यूडब्ल्यू डिपार्टमेंट ऑफ बायोकैमिस्ट्री एंडोमेंट के समर्थन से स्थापित किया गया था। इस काम को राष्ट्रीय नेत्र संस्थान (R01EY022086 से A. Ikeda) के अनुदान द्वारा भी समर्थित किया गया था; आर 01ईवाई031748 सी बोवेज रिकमैन को; यूडब्ल्यू में ओप्थाल्मोलॉजी और विजुअल साइंसेज विभाग के लिए पी 30ईवाई016665; ड्यूक आई सेंटर के लिए पी 30ईवाई005722; एनआईएच टी 32ईवाई027721 से एम लैंडोव्स्की; लैंडोव्स्की, टिमोथी विलियम ट्राउट अध्यक्ष (ए इकेदा), एफएफबी फ्री फैमिली एएमडी अवार्ड (सी बोवेज रिकमैन); और अंधापन को रोकने के लिए अनुसंधान (ड्यूक आई सेंटर) से एक अप्रतिबंधित अनुदान।
0.1 M Cacodylate Buffer pH7.2 | PolyScientiifc R&D Company | S1619 | |
100 Capacity Slide Box | Two are needed for this protocol (one for H&E-stained slides and one for RPE flat mounts.) | ||
100% Ethanol | MDS Warehouse | 2292-CASE | Can be used to make diluted ethanol solutions in this protocol. |
1-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks | Qosina | 11069 | |
1x Phosphate Buffer Solution (PBS) | Premade 1x PBS can be used in this protocol. | ||
2.0 mL microtubes | Genesee Scientific | 24-283-LR | |
24 Cavity Embedding Capsule Substitute Mold | Electron Microscopy Sciences | 70165 | |
24 inch PVC Tubing with Luer Ends | Fisher Scientific | NC1376778 | |
400 Mesh Gilder Thin Bar Square Mesh Grids | Electron Microscopy Sciences | T400-Cu | |
95% Ethanol | MDS Warehouse | 2293-CASE | |
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier (23 inches by 24 inches) | VWR | 56616-031 | |
Adjustable 237 ml Spray Bottle | VWR | 23609-182 | |
Alexa Fluor488 Conjugated Donkey anti-Rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | |
Aluminum Foil | |||
BD Precision glide 19 Gauge Syringe Needle | Sigma-Aldrich | Z192546 | |
Bracken Forceps; Curved; Fine Cross Serrations; 4" Length, 1 mm Tip Width | Roboz Surgical Instrument | RS-5211 | Known as curved forceps in this protocol. |
Camel Hair Brush | Electron Microscopy Sciences | 65575-02 | |
Carbon Dioxide Euthanasia Chamber | |||
Carbon Dioxide Flow Meter | |||
Carbon Dioxide Tank | |||
Castaloy Prong Extension Clamps | Fisher Scientific | 05-769-7Q | |
Cast-Iron L-shaped Base Support Stand | Fisher Scientific | 11-474-207 | |
Cell Prolifer Program | Available to download: https://cellprofiler.org/releases | ||
Clear Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
Colorfrost Microscope Slides Lavender | VWR | 10118-956 | |
Computer | |||
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-5MG | |
Distilled H20 | Water from Milli-Q Purification System was used in this protocol. | ||
Dumont Thin Tip Tweezers; Pattern #55 | Roboz Surgical Instrument | RS-4984 | Known as fine-tipped forceps in this protocol, and 3 are needed for this protocol (two for dissections and one for electron microscope processing). |
Electron Microscopy Grid Holder | Electron Microscopy Sciences | 71147-01 | |
EPON 815 Resin | Electron Microscopy Sciences | 14910 | |
Epredia Mark-It Tissue Marking Yellow Dye | Fisher Scientific | 22050460 | Please follow manufacturer's protocol when using this tissue marking dye. |
Epredia Mounting Media | Fisher Scientific | 22-110-610 | Use for mounting H&E slides. |
Fiber-Lite Mi-150 Illuminator Series,150 w Halogen Light Source | Dolan-Jenner Industries | Mi-150 | Light source for dissecting microscope. |
Fiji ImageJ Program | Available to download: https://imagej.net/downloads | ||
Flexaframe Castaloy Hook Connector | Thermo Scientific | 14-666-18Q | |
Fume hood | |||
Glutaraldehyde 2.5% in Phosphate Buffer, pH 7.4, 32% | Electron Microscopy Sciences | 16537-05 | |
JEM-1400 Transmission Electron Microscope (JEOL) with an ORIUS (1000) CCD Camera | |||
Laboratory Benchtop Shaker | Two are needed for these experiments. One should be at room temperature while the other should be in a 4 degree Celsius cold room. | ||
Laser Cryo Tag Labels | Electron Microscopy Sciences | 77564-05 | |
Lead Citrate | Electron Microscopy Sciences | 17800 | |
Leica EM UC7Ultramicrotome | |||
Leica Reichert Ultracut S Microtome | |||
LifterSlips | Thermo Fisher Scientific | 22X22I24788001LS | Use these coverslips for the RPE flat mounts as they have raised edges and accommodate the thickness of the RPE. |
Mayer's Hematoxylin | VWR | 100504-406 | |
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5600 | Known as micro-dissecting scissors in protocol. |
Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
Mice | Any AMD mouse model and its respective controls can work for this protocol. | ||
Micro Dissecting Scissors; Standard Version; Curved; Sharp Points; 24 mm Blade Length; 4.5" Overall Length | Roboz Surgical Instrument | RS-5913 | Known as curved scissors in this protocol. |
Microsoft Excel | |||
Microtube racks | |||
Nikon A1RS Confocal Microscope | |||
Normal Donkey Serum | SouthernBiotech | 0030-01 | |
Number 11 Sterile Disposable Scalpel Blades | VWR | 21909-380 | |
Osmium Tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19150 | |
Paraformaldehyde, 32% | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
Pencil | |||
Petri Dish | VWR | 21909-380 | |
Pipette Tips | |||
Pipettes | |||
Polyclonal Anti-ZO-1 Antibody | Thermo Fisher Scientific | 402200 | |
Propylene Oxide | Electron Microscopy Sciences | 20412 | |
Razor Blade | VWR | 10040-386 | |
Shallow Tray for Mouse Perfusions | |||
Shandon Eosin Y Alcoholic | VWR | 89370-828 | |
Sharpie Ultra Fine Tip Black Permanent Marker | Staples | 642736 | |
Slide Rack for Staining | Grainger | 49WF31 | |
Squared Cover Glass Slips | Fisher Scientific | 12-541B | |
Staining Dish with Cover | Grainger | 49WF30 | Need 15 for H&E staining procedure. |
Target All-Plastic Disposable Luer-Slip 50 mL Syringe | Thermo Scientific | S7510-50 | Use only the syringe barrel. |
Timer | Fisher | 1464917 | |
Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | |
Vacuum Oven | |||
Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | Use for mounting RPE flat mounts. |
Xylene | Fisher Scientific | 22050283 | |
Zeiss Axio Imager 2 Light Microscope | This microscope has the capacity to generate stitched 20x images. If a light microscope does not have this capacity, then take images of the entire retina that are slightly overlapping each other. Use Adobe Photoshop to stitch these images together. Please refer to the manuals of the Adobe Photoshop program for image stitching. | ||
Zeiss Stemi 2000 Dissecting Microscope | Electron Microscopy Sciences | 65575-02 |