Summary

Protocole d’évaluation et de quantification des pathologies de l’épithélium pigmenté rétinien dans des modèles murins de dégénérescence maculaire liée à l’âge

Published: March 10, 2023
doi:

Summary

Les modèles murins peuvent être des outils utiles pour étudier la biologie de l’épithélium pigmenté rétinien (EPR). Il a été établi que les souris peuvent développer un éventail de pathologies RPE. Ici, nous décrivons un protocole de phénotypage pour élucider et quantifier les pathologies RPE chez la souris en utilisant la lumière, l’électron de transmission et la microscopie confocale.

Abstract

La dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) est un trouble rétinien débilitant chez les populations vieillissantes. Il est largement admis que le dysfonctionnement de l’épithélium pigmenté rétinien (EPR) est un événement pathobiologique clé dans la DMLA. Pour comprendre les mécanismes qui conduisent au dysfonctionnement de l’EPR, les chercheurs peuvent utiliser des modèles murins. Il a été établi par des études antérieures que les souris peuvent développer des pathologies RPE, dont certaines sont observées dans les yeux des personnes diagnostiquées avec la DMLA. Nous décrivons ici un protocole de phénotypage pour évaluer les pathologies de l’EPR chez la souris. Ce protocole comprend la préparation et l’évaluation de coupes transversales rétiniennes par microscopie optique et microscopie électronique à transmission, ainsi que celle de montures plates RPE par microscopie confocale. Nous détaillons les types courants de pathologies de l’EPR murin observés par ces techniques et les moyens de les quantifier grâce à des méthodes non biaisées pour les tests statistiques. Comme preuve de concept, nous utilisons ce protocole de phénotypage RPE pour quantifier les pathologies RPE observées chez les souris surexprimant la protéine transmembranaire 135 (Tmem135) et les souris âgées de type sauvage C57BL/6J. L’objectif principal de ce protocole est de présenter des méthodes de phénotypage RPE standard avec des évaluations quantitatives non biaisées pour les scientifiques utilisant des modèles murins de DMLA.

Introduction

La dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) est une maladie cécitante courante qui touche les populations de plus de 55 ans1. De nombreux chercheurs pensent que le dysfonctionnement de l’épithélium pigmenté rétinien (EPR) est un événement pathobiologique précoce et crucial dans la DMLA2. L’EPR est une monocouche de cellules polarisées chargée de maintenir l’homéostasie des photorécepteurs voisins et des vaisseaux sanguins choroïdiens3. Il existe divers modèles pour étudier les mécanismes associés à la maladie au sein de l’EPR, y compris les modèles de culture cellulaire 4,5 et les souris 6,7,8. Un rapport récent a décrit des protocoles normalisés et des critères de contrôle de la qualité pour les modèles de culture cellulaire EPR4, mais aucun rapport n’a tenté de normaliser le phénotypage de l’EPR dans les modèles murins. En fait, de nombreuses publications sur des modèles murins de DMLA manquent d’une description complète de l’EPR ou d’une quantification des pathologies de l’EPR qu’ils contiennent. L’objectif global de ce protocole est de présenter des méthodes de phénotypage RPE standard avec des évaluations quantitatives non biaisées pour les scientifiques utilisant des modèles murins AMD.

Des publications antérieures ont noté la présence de plusieurs pathologies RPE chez la souris grâce à trois techniques d’imagerie. Par exemple, la microscopie optique permet aux chercheurs de visualiser la morphologie grossière de la rétine murine (Figure 1A) et de détecter des pathologies de l’EPR telles que l’amincissement de l’EPR, la vacuolisation et la migration. L’amincissement de l’EPR dans un modèle murin AMD est illustré par un écart de la hauteur de l’EPR par rapport à leurs contrôles respectifs (Figure 1B). La vacuolisation de l’EPR peut être divisée en deux catégories distinctes : la microvacuolisation (figure 1C) et la macrovacuolisation (figure 1D). La microvacuolisation de l’EPR est résumée par la présence de vacuoles dans l’EPR qui n’affectent pas sa hauteur totale, tandis que la macrovacuolisation est indiquée par la présence de vacuoles qui font saillie dans les segments externes des photorécepteurs. La migration de l’EPR se distingue par l’agrégat focal de pigment au-dessus de la monocouche de l’EPR dans une section transversale rétinienne (Figure 1E). Il convient de noter que les cellules EPR migratrices dans les yeux des donneurs de DMLA présentent une immunoréactivité aux marqueurs des cellules immunitaires, tels que le groupe de différenciation 68 (CD68)9, et pourraient représenter des cellules immunitaires engloutissant des débris d’EPR ou des EPR subissant une transdifférenciation 9. Une autre technique d’imagerie appelée microscopie électronique à transmission peut permettre aux chercheurs de visualiser l’ultrastructure de l’EPR et de sa membrane basale (Figure 2A). Cette technique permet d’identifier le dépôt sous-RPE prédominant chez la souris, connu sous le nom de dépôt laminaire basal (BLamD) (Figure 2B)10. Enfin, la microscopie confocale peut révéler la structure des cellules EPR grâce à l’imagerie des supports plats de l’EPR (Figure 3A). Cette méthode permet de découvrir la dysmorphie de l’EPR, c’est-à-dire la déviation de l’EPR par rapport à sa forme classique en nid d’abeille (Figure 3B). Il peut également détecter la multinucléation de l’EPR, la présence de trois noyaux ou plus dans une cellule EPR (Figure 3C). Pour un résumé des types de pathologies RPE présentes dans les modèles murins DMLA actuels, nous renvoyons les chercheurs à ces revues de la littérature 6,7.

Les chercheurs qui étudient la DMLA devraient être conscients des avantages et des inconvénients de l’utilisation de souris pour étudier les pathologies de l’EPR avant le protocole de phénotypage. Les souris sont avantageuses en raison de leur durée de vie relativement courte et de leur rentabilité, ainsi que de leur manipulabilité génétique et pharmacologique. Les souris présentent également des changements dégénératifs de l’EPR, y compris la migration de l’EPR, la dysmorphie et la multinucléation, qui sont observés dans les yeux des donneurs de DMLA 11,12,13,14,15,16,17; cela suggère que des mécanismes similaires peuvent sous-tendre le développement de ces pathologies RPE chez la souris et l’homme. Cependant, il existe des différences clés qui limitent la transposabilité des études sur les souris à la DMLA humaine. Premièrement, les souris n’ont pas de macula, une région anatomiquement distincte de la rétine humaine nécessaire à l’acuité visuelle qui est préférentiellement affectée dans la DMLA. Deuxièmement, certaines pathologies de l’EPR chez la souris, comme l’amincissement et la vacuolisation de l’EPR, ne sont généralement pas observées dans les yeux des donneurs de DMLA18. Troisièmement, les souris ne développent pas de drusen, une caractéristique de la pathologie DMLA19. Les Drusen sont des dépôts contenant des lipides et des protéines avec très peu de protéines de la membrane basale qui se forment entre la lame basale RPE et la couche collagène interne de la membrane de Bruch (BrM)19. Drusen diffère de BLamD, le dépôt sous-RPE commun chez la souris, à la fois dans sa composition et sa localisation anatomique. Les BLamD sont des anomalies enrichies par la matrice extracellulaire dépendantes de l’âge et du stress qui se forment entre la lame basale RPE de BrM et les repliements basaux du RPE20. Fait intéressant, les BLamD ont une composition protéique et une apparence similaires chez les souris et les humains 6,10,21. Des travaux récents suggèrent que les BLamD peuvent agir dans la pathobiologie de la DMLA en influençant la progression de la DMLA vers ses stades ultérieurs18,22 ; ainsi, ces dépôts peuvent représenter un EPR malade dans la rétine de la souris. La connaissance de ces avantages et limites est essentielle pour les chercheurs intéressés à traduire les résultats d’études sur la souris à la DMLA.

Dans ce protocole, nous discutons des méthodes de préparation des yeux à la lumière, à l’électron de transmission et à la microscopie confocale pour visualiser les pathologies de l’EPR. Nous décrivons également comment quantifier les pathologies de l’EPR de manière impartiale pour les tests statistiques. Comme preuve de concept, nous utilisons le protocole de phénotypage RPE pour étudier les pathologies structurelles de l’EPR observées chez les souris surexprimant la protéine transmembranaire 135- (Tmem135) et les souris âgées de type sauvage (WT) C57BL/6J. En résumé, nous visons à décrire la méthodologie de phénotypage pour caractériser l’EPR dans les modèles murins AMD, car il n’existe actuellement aucun protocole standard disponible. Les chercheurs intéressés par l’examen et la quantification des pathologies des photorécepteurs ou des choroïdes, qui sont également affectées dans les modèles murins DMLA, peuvent ne pas trouver ce protocole utile pour leurs études.

Protocol

Toutes les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université du Wisconsin-Madison et sont conformes à la déclaration de l’Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) pour l’utilisation d’animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle. 1. Évaluation de l’EPR chez la souris par microscopie optique Fabriquez un tampon fixateur qui a une con…

Representative Results

L’achèvement du protocole de phénotypage RPE décrit dans cet article fournit une analyse quantitative des anomalies structurelles de l’EPR couramment observées dans les modèles murins de DMLA. Pour confirmer l’efficacité de ce protocole, nous l’avons utilisé chez des souris connues pour présenter des pathologies de l’EPR, y compris des souris transgéniques qui surexpriment WT Tmem135 entraînées par le promoteur de la bêta-actine de poulet (Tmem135 TG)30 et des souris C57BL/6J âgées<sup cl…

Discussion

Dans cet article, nous avons présenté un protocole de phénotypage pour évaluer les pathologies structurelles de l’EPR de modèles murins. Nous avons décrit les étapes nécessaires au traitement des yeux pour diverses techniques d’imagerie telles que la lumière, l’électron de transmission et la microscopie confocale, ainsi que la quantification des pathologies typiques observées via ces méthodes d’imagerie. Nous avons prouvé l’efficacité de notre protocole de phénotypage RPE en examinant <e…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs tiennent à remercier Satoshi Kinoshita et le laboratoire TRIP (Translational Research Initiatives in Pathology Medicine) de l’Université du Wisconsin (UW) pour avoir préparé nos tissus à la microscopie optique. Ce noyau est soutenu par le Département de pathologie et de médecine de laboratoire de l’UW, le Centre de cancérologie Carbone de l’Université du Wisconsin (P30 CA014520) et le Bureau du directeur-NIH (S10OD023526). La microscopie confocale a été réalisée au noyau optique de biochimie de l’UW, qui a été créé avec le soutien du Département de dotation en biochimie de l’UW. Ce travail a également été soutenu par des subventions du National Eye Institute (R01EY022086 à A. Ikeda; R01EY031748 à C. Bowes Rickman; P30EY016665 au Département d’ophtalmologie et de sciences visuelles de l’UW; P30EY005722 au Duke Eye Center; NIH T32EY027721 à M. Landowski; F32EY032766 à M. Landowski), Timothy William Trout Présidence (A. Ikeda), FFB Free Family AMD Award (C. Bowes Rickman); et une subvention sans restriction de la Research to Prevent Blindness (Duke Eye Center).

Materials

0.1 M Cacodylate Buffer pH7.2 PolyScientiifc R&D Company S1619
100 Capacity Slide Box Two are needed for this protocol (one for H&E-stained slides and one for RPE flat mounts.)
100% Ethanol  MDS Warehouse 2292-CASE Can be used to make diluted ethanol solutions in this protocol.
1-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks Qosina 11069
1x Phosphate Buffer Solution (PBS) Premade 1x PBS can be used in this protocol. 
2.0 mL microtubes Genesee Scientific  24-283-LR
24 Cavity Embedding Capsule Substitute Mold Electron Microscopy Sciences 70165
24 inch PVC Tubing with Luer Ends Fisher Scientific NC1376778
400 Mesh Gilder Thin Bar Square Mesh Grids Electron Microscopy Sciences T400-Cu
95% Ethanol MDS Warehouse 2293-CASE
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier (23 inches by 24 inches) VWR 56616-031
Adjustable 237 ml  Spray Bottle VWR 23609-182
Alexa Fluor488 Conjugated Donkey anti-Rabbit IgG  Thermo Fisher Scientific A-21206
Aluminum Foil
BD Precision glide 19 Gauge Syringe Needle Sigma-Aldrich  Z192546
Bracken Forceps; Curved; Fine Cross Serrations; 4" Length, 1 mm Tip Width Roboz Surgical Instrument RS-5211 Known as curved forceps in this protocol.
Camel Hair Brush Electron Microscopy Sciences 65575-02
Carbon Dioxide Euthanasia Chamber
Carbon Dioxide Flow Meter
Carbon Dioxide Tank
Castaloy Prong Extension Clamps Fisher Scientific  05-769-7Q
Cast-Iron L-shaped Base Support Stand Fisher Scientific  11-474-207
Cell Prolifer Program Available to download: https://cellprofiler.org/releases
Clear Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180
Colorfrost Microscope Slides Lavender VWR 10118-956
Computer
DAPI Sigma-Aldrich D9542-5MG
Distilled H20 Water from Milli-Q Purification System was used in this protocol.
Dumont Thin Tip Tweezers; Pattern #55 Roboz Surgical Instrument RS-4984 Known as fine-tipped forceps in this protocol, and 3 are needed for this protocol (two for dissections and one for electron microscope processing).
Electron Microscopy Grid Holder Electron Microscopy Sciences 71147-01
EPON 815 Resin Electron Microscopy Sciences 14910
Epredia Mark-It Tissue Marking Yellow Dye Fisher Scientific  22050460 Please follow manufacturer's protocol when using this tissue marking dye. 
Epredia Mounting Media Fisher Scientific 22-110-610 Use for mounting H&E slides. 
Fiber-Lite Mi-150 Illuminator Series,150 w Halogen Light Source Dolan-Jenner Industries Mi-150 Light source for dissecting microscope.
Fiji ImageJ Program Available to download: https://imagej.net/downloads
Flexaframe Castaloy Hook Connector Thermo Scientific   14-666-18Q
Fume hood
Glutaraldehyde 2.5% in Phosphate Buffer, pH 7.4, 32% Electron Microscopy Sciences 16537-05
JEM-1400 Transmission Electron Microscope (JEOL) with an ORIUS (1000) CCD Camera
Laboratory Benchtop Shaker Two are needed for these experiments. One should be at room temperature while the other should be in a 4 degree Celsius cold room.
Laser Cryo Tag Labels Electron Microscopy Sciences 77564-05
Lead Citrate Electron Microscopy Sciences 17800
Leica EM UC7Ultramicrotome
Leica Reichert Ultracut S Microtome
LifterSlips Thermo Fisher Scientific 22X22I24788001LS Use these coverslips for the RPE flat mounts as they have raised edges and accommodate the thickness of the RPE.
Mayer's Hematoxylin VWR 100504-406
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors Roboz Surgical Instrument RS-5600 Known as micro-dissecting scissors in protocol. 
Methanol Fisher Scientific  A412-4
Mice Any AMD mouse model and its respective controls can work for this protocol.
Micro Dissecting Scissors; Standard Version; Curved; Sharp Points; 24 mm Blade Length; 4.5" Overall Length Roboz Surgical Instrument RS-5913 Known as curved scissors in this protocol.
Microsoft Excel
Microtube racks
Nikon A1RS Confocal Microscope
Normal Donkey Serum SouthernBiotech 0030-01
Number 11 Sterile Disposable Scalpel Blades VWR 21909-380
Osmium Tetroxide  Electron Microscopy Sciences 19150
Paraformaldehyde, 32% Electron Microscopy Sciences 15714-S
Pencil
Petri Dish VWR  21909-380
Pipette Tips
Pipettes 
Polyclonal Anti-ZO-1 Antibody Thermo Fisher Scientific 402200
Propylene Oxide Electron Microscopy Sciences 20412
Razor Blade VWR 10040-386
Shallow Tray for Mouse Perfusions
Shandon Eosin Y Alcoholic VWR 89370-828
Sharpie Ultra Fine Tip Black Permanent Marker Staples 642736
Slide Rack for Staining Grainger 49WF31
Squared Cover Glass Slips Fisher Scientific  12-541B
Staining Dish with Cover Grainger 49WF30 Need 15 for H&E staining procedure.
Target All-Plastic Disposable Luer-Slip 50 mL Syringe  Thermo Scientific  S7510-50 Use only the syringe barrel.
Timer Fisher 1464917
Uranyl Acetate Electron Microscopy Sciences 22400
Vacuum Oven
Vectashield Mounting Medium Vector Laboratories H-1000 Use for mounting RPE flat mounts. 
Xylene Fisher Scientific  22050283
Zeiss Axio Imager 2 Light Microscope This microscope has the capacity to generate stitched 20x images. If a light microscope does not have this capacity, then take images of the entire retina that are slightly overlapping each other. Use Adobe Photoshop to stitch these images together. Please refer to the manuals of the Adobe Photoshop program for image stitching. 
Zeiss Stemi 2000 Dissecting Microscope Electron Microscopy Sciences 65575-02

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Landowski, M., Grindel, S., Hao, Y., Ikeda, S., Bowes Rickman, C., Ikeda, A. A Protocol to Evaluate and Quantify Retinal Pigmented Epithelium Pathologies in Mouse Models of Age-Related Macular Degeneration. J. Vis. Exp. (193), e64927, doi:10.3791/64927 (2023).

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