Das vorliegende Protokoll beschreibt die Reinigungsschritte und anschließenden Studien von vier verschiedenen pilzlichen β-Glucanen als potentielle immunmodulatorische Moleküle, die die antitumoralen Eigenschaften von Mikroglia gegen Glioblastomzellen verbessern.
Eine der größten Herausforderungen bei der Entwicklung wirksamer Therapien gegen das Glioblastom ist die Überwindung der starken Immunsuppression in der Tumormikroumgebung. Die Immuntherapie hat sich als wirksame Strategie herausgestellt, um die Reaktion des Immunsystems gegen Tumorzellen zu richten. Gliom-assoziierte Makrophagen und Mikroglia (GAMs) sind wichtige Treiber solcher entzündungshemmenden Szenarien. Daher könnte die Verstärkung des antikanzerösen Ansprechens bei GAMs eine potenzielle co-adjuvante Therapie zur Behandlung von Glioblastom-Patienten darstellen. In diesem Sinne sind pilzliche β-Glucan-Moleküle seit langem als starke Immunmodulatoren bekannt. Ihre Fähigkeit, die angeborene Immunaktivität zu stimulieren und das Ansprechen auf die Behandlung zu verbessern, wurde beschrieben. Diese modulierenden Eigenschaften werden zum Teil auf ihre Fähigkeit zurückgeführt, an Mustererkennungsrezeptoren zu binden, die interessanterweise in GAMs stark exprimiert werden. Daher konzentriert sich diese Arbeit auf die Isolierung, Reinigung und anschließende Verwendung von pilzlichen β-Glucanen zur Verbesserung der tumoriziden Reaktion von Mikroglia gegen Glioblastomzellen. Die Maus-Zelllinien Glioblastom (GL261) und Mikroglia (BV-2) werden verwendet, um die immunmodulatorischen Eigenschaften von vier verschiedenen pilzlichen β-Glucanen zu testen, die aus Pilzen extrahiert werden, die in der aktuellen biopharmazeutischen Industrie stark verwendet werden: Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus und Ganoderma lucidum. Um diese Verbindungen zu testen, wurden Co-Stimulations-Assays durchgeführt, um die Wirkung eines voraktivierten Mikroglia-konditionierten Mediums auf die Proliferation und Apoptose-Aktivierung in Glioblastomzellen zu messen.
Trotz neuer Errungenschaften auf dem Gebiet der Neuroonkologie ist die Lebenserwartung von Glioblastom-Patienten nach wie vor gering. Goldstandard-Therapien gegen Hirntumore basieren auf der Verschmelzung von Operation, Strahlentherapie und Chemotherapie. In den letzten zehn Jahren hat sich die Immuntherapie jedoch zu einer wirksamen Strategie zur Behandlung verschiedener Krebsarten entwickelt1. So ist die Möglichkeit, die körpereigene Immunantwort gegen Tumorzellen nutzbar zu machen, in jüngster Zeit zur vierten Säule der Onkologie geworden.
Es ist seit langem bekannt, dass eine der größten Herausforderungen auf diesem Gebiet darin besteht, die starke Immunsuppression in der Tumormikroumgebung zu überwinden2. Insbesondere im Fall des Glioblastoms, einer der häufigsten und aggressivsten Formen von Hirntumoren, könnte die Entschlüsselung wichtiger Signalwege, die solche pro-tumoralen Szenarien orchestrieren, und die Suche nach neuen Verbindungen, die der depressiven Reaktion des Immunsystems entgegenwirken könnten, den Weg für zukünftige Therapien gegen diese unheilbare Krankheit ebnen.
Das Gehirn besitzt eigene Zellen des Immunsystems, und der relevanteste Zelltyp sind Mikroglia. Es wurde nachgewiesen, dass diese Zellen ein ziemlich komplexes Verhalten bei verschiedenen zentralen Krankheiten aufweisen3. Bei primären Hirntumoren (z.B. Glioblastom) werden diese Zellen in Richtung eines antiinflammatorischen Phänotyps verschoben, der Tumorzellen bei der Besiedlung des Hirnparenchyms unterstützt3. Zahlreiche Veröffentlichungen belegen die wichtige Rolle dieser Zellen bei der Tumorprogression. Einer der Hauptgründe dafür ist, dass Gliom-assoziierte Mikroglia und infiltrierte Makrophagen (GAMs) ein Drittel der gesamten Tumormasse ausmachen, was auf den eindeutigen Einfluss ihrer Aktivierungszustände während der Progression von Hirntumoren hindeutet 4,5.
In diesem Sinne wurden pilzliche β-Glucane als starke Moleküle beschrieben, die wirksame Immunreaktionen auslösen, einschließlich Phagozytose und Produktion entzündungsfördernder Faktoren, was zur Eliminierung schädlicher Stoffe führt 6,7,8,9,10. Pilze β-Glucane wurden im Allgemeinen mit Extrakten aus verschiedenen Pilzteilen untersucht. Die Zuordnung spezifischer Wirkungen erfordert jedoch eine Reinigung, um Mehrdeutigkeiten zu vermeiden und den Wirkmechanismus solcher Moleküle als immunmodulatorische Wirkstoffe verstehen zu können8.
In dieser Arbeit werden lösliche β-Glucane aus dem Fruchtkörper von vier verschiedenen Pilzen gereinigt, die regelmäßig als essbare (Pleurotus ostreatus und Pleurotus djamor) und als Heilpilze (Ganoderma lucidum und Hericium erinaceus) verwendet werden. Insbesondere in der Lebensmittel- und Pharmaindustrie finden diese vier Pilze große Verwendung und wurden im Rahmen einer umweltfreundlichen Kreislaufwirtschaft in einem Gewerbebetrieb hergestellt (siehe Materialtabelle).
Um den Grundstein für den zukünftigen Einsatz von Pilz-β-Glucanen in der Therapie von Hirntumoren zu legen, sind klar definierte Aufreinigungsstrategien und präklinische Studien, die sich mit ihrer mutmaßlichen Interaktion mit Zellen des Immunsystems befassen, unerlässlich, um ihre potenzielle Rolle als Anti-Tumor-Mediatoren zu bewerten. Diese Arbeit beschreibt die zahlreichen Schritte der Isolierung und Reinigung, die erforderlich sind, um die löslichen β-Glucane zu gewinnen, die in den Fruchtkörpern des ausgewählten Pilzes enthalten sind. Nach erfolgreicher Reinigung werden die Mikrogliazellen aktiviert, um ihren entzündlichen Phänotyp zu verstärken. Maus-Glioblastomzellen (GL261) werden mit einem anderen Mikroglia-konditionierten Medium beschichtet, das zuvor mit diesen Extrakten behandelt wurde, und dann wird seine Wirkung auf das Verhalten der Tumorzellen untersucht. Interessanterweise haben Pilotstudien aus unserem Labor (Daten nicht gezeigt) aufgedeckt, wie entzündungsfördernde Mikroglia die Migration von Tumorzellen und die Invasionseigenschaften nicht nur in Glioblastomzellen, sondern auch in anderen Krebszelllinien verlangsamen können. Diese multidisziplinäre Arbeit könnte ein nützliches Werkzeug für Onkologieforscher sein, um vielversprechende Wirkstoffe zu testen, die in der Lage sind, die Immunantwort bei vielen verschiedenen Tumorarten zu verstärken.
Diese Arbeit beschreibt die Verwendung etablierter Techniken zur erfolgreichen Isolierung, Reinigung und Charakterisierung des Gehalts an SβGs aus vier verschiedenen Pilzen. Die Ergebnisse zeigten, wie nach der Heißwasserextraktion von SMPs, die aus P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum und H. erinaceus gewonnen wurden, gefolgt von einer hydrolytischen Behandlung mit α-Amylase, Glucosidase und Protease, der Gehalt an α-Glucan und Protein reduziert wurde, wodurch die Menge an reinen S…
The authors have nothing to disclose.
Wir bedanken uns bei Dr. Vasiliki Economopoulos für ihr hauseigenes Skript zur Messung des Fuluoreszenz-Signals in ImageJ. Wir möchten uns auch bei der CITIUS (Universität Sevilla) und ihrem gesamten Personal für die Unterstützung während der Demonstration bedanken. Diese Arbeit wurde vom spanischen FEDER I + D + i-USE, US-1264152 der Universität Sevilla, und dem Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades PID2021-126090OA-I00 unterstützt
8-well chamber slides | Thermo Fisher, USA | 171080 | |
Air-drying oven | J.P. Selecta S.A., Spain | 2000210 | |
Albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis | A7030 | |
Alcalase | Novozymes, Denmark | protease | |
Alexa Fluor 488 | Thermofisher, USA | A32731 | |
Alexa Fluor 647 | Thermofisher, USA | A32728 | |
Blade mill | Retsch, Germany | SM100 | |
Bovine Serum Albumin | MERK, Germany | A9418 | |
Cellulose tubing membrane | Sigma-Aldrich, St. Louis | D9402 | |
Centrifuge | MERK, Germany | Eppendorf, 5810R | |
Colocalisation pluggins | ImageJ | (https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis ) | |
DAPI | MERK, Germany | 28718-90-3 | |
Dextrans | Pharmacosmos, Holbalk, Denmark | Dextran 410, 80, 50 | |
Dulbecco´s modified Eagle´s medium, Gluta MAXTM | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | 10564011 | |
Extenda (α- Amylase/Glucoamylase) | Novozymes, Denmark | ||
Fetal bovine serum | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | A4736301 | |
FT-IR spectromete | Bruker-Vertex, Switzerland | VERTEX 70v | |
Graphing and analysis software | GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.) | ||
H2SO4 | |||
HPLC system | Waters Corp, Milford, MA, USA | Waters 2695 HPLC | |
Incubator | Eppedorf | Galaxy 170S | |
Mass Spectometer | Q Exactive GC, Thermo Scientific | 725500 | |
Paraformaldehyde | MERK, Germany | P6148 | |
Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich, St. Louis | P4458 | |
pH meter | Crison, Barcelona, Spain | Basic 20 | |
Phosphate-buffered saline | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | 1010-015 | |
Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody | Abcam, UK | ab243998 | |
Rat Ki-67 Monoclonal | Thermofisher, USA | MA5-14520 | |
Rotary evaporator | Büchi Ibérica S.L.U., Spain | El Rotavapor R-100 | |
Ultra-hydrogel linear gel-filtration column (300 mm x 7.8 mm) | Waters Corp, Milford, MA, USA | WAT011545 | |
UV-Visible spectrophotometer | Amersham Bioscience, UK | Ultrospec 2100 pro | |
VectaMount | Vector Laboratories, C.A, USA | H-5000-60 | |
Water bath | J.P. Selecta S.A., Spain | ||
Zeiss LSM 7 DUO Confocal Microscope System. | Zeiss, Germany | ||
β-glucan Assay Kit | Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland | K-BGLU | |
β-glucans | Setas y Hongos del Sur, S.L. | Supplied the four variants of mushrooms |