JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Traducción Automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medio ambiente

Cytotoxicitetsanalyser med zebrafiskcellinjer

Published: January 06, 2023
doi:
10.3791/64860
, , , , , , , , ,
1Graduate Program in Genetics, Department of Genetics,Federal University of Paraná (UFPR), 2Safety of Product Department,Grupo Boticário, 3Department of Genetics,Federal University of Paraná (UFPR)

Summary

Detta protokoll presenterar vanliga cytotoxicitetsanalyser (Alamar Blue [AB], CFDA-AM, Neutral Red och MTT-analyser) anpassade för bedömning av cytotoxicitet i zebrafiskembryon (ZEM2S) och lever (ZFL) cellinjer i 96-brunnsplattor.

Abstract

Fiskcellinjer har blivit alltmer använda i ekotoxicitetsstudier, och cytotoxicitetsanalyser har föreslagits som metoder för att förutsäga akut toxicitet hos fisk. Således presenterar detta protokoll cytotoxicitetsanalyser modifierade för att utvärdera cellviabilitet i zebrafisk (Danio rerio) embryo (ZEM2S) och lever (ZFL) cellinjer i 96-brunnsplattor. De utvärderade cytotoxicitetseffektmåtten är mitokondriell integritet (Alamar Blue [AB] och MTT-analyser), membranintegritet via esterasaktivitet (CFDA-AM-analys) och lysosomal membranintegritet (Neutral Red [NR] -analys). Efter exponering av testämnena i en platta med 96 brunnar utförs cytotoxicitetstesterna. här utförs AB och CFDA-AM samtidigt, följt av NR på samma platta, medan MTT-analysen utförs på en separat platta. Avläsningarna för dessa analyser görs genom fluorescens för AB och CFDA-AM och absorbans för MTT och NR. De cytotoxicitetsanalyser som utförs med dessa fiskcellinjer kan användas för att studera den akuta toxiciteten hos kemiska ämnen på fisk.

Introduction

Kemiska ämnen måste testas med avseende på deras säkerhet för människors hälsa och miljön. Molekylära och cellulära biomarkörer har i allt högre grad övervägts i säkerhetsbedömningar för att förutsäga effekter på levande organismer av tillsynsmyndigheter och/eller lagstiftning (t.ex. REACH, OECD, US EPA)1,2, eftersom de kan föregå det negativa resultatet in vivo (t.ex. endokrina störningar, immunologiskt svar, akut toxicitet, fototoxicitet)3,4,5,6,7 . I detta sammanhang har cytotoxicitet använts som ett mått för att förutsäga akut toxicitethos fisk 5,8. Det kan dock ha många andra tillämpningar i ekotoxicitetsstudier, såsom att definiera subcytotoxiska koncentrationer av kemiska ämnen för att studera deras mest olika uppsättning effekter på fisk (t.ex. hormonstörande effekter).

I cellodlingssystem (in vitro-system ) kan kemiska substansers cytotoxicitet bestämmas med metoder som skiljer sig åt i typen av endpoints. Till exempel kan en cytotoxicitetsmetod baseras på en slutpunkt relaterad till specifik morfologi observerad under celldödsprocessen, medan en annan kan bestämma cytotoxicitet genom mätning av celldöd, livskraft och funktionalitet, morfologi, energimetabolism och cellbindning och proliferation. Kemiska substanser kan påverka cellviabiliteten genom olika mekanismer, och därför är cytotoxicitetsbedömning som omfattar olika endpoints för cellviabilitet nödvändig för att förutsäga kemiska effekter9.

MTT och Alamar Blue (AB) är analyser som bestämmer effekter på cellviabilitet baserat på cellmetabolisk aktivitet. MTT-analysen utvärderar aktiviteten hos det mitokondriella enzymet succinatdehydrogenas10. Reduktionen av gulaktig 3-[4,5-dimetyltiazol-2yl]-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) till formazanblått sker endast i viabla celler, och dess optiska densitet är direkt proportionell mot antalet viabla celler10. AB-analysen är en känslig oxidationsreduktionsindikator, medierad av mitokondriella enzymer som fluorescerar och ändrar färg när resazurin reduceras till resorufin av levande celler11; cytosoliska och mikrosomala enzymer bidrar emellertid också till minskningen av AB och MTT12. Dessa enzymer kan innefatta flera reduktaser, såsom alkohol- och aldehydoxidoreduktaser, NAD(P)H: kinonoxidoreduktas, flavinreduktas, NADH-dehydrogenas och cytokromer11.

Neutralröd (NR) -analysen är en cellviabilitetsanalys baserad på införlivandet av detta färgämne i lysosomerna i livskraftiga celler13. Upptaget av NR beror på cellernas förmåga att upprätthålla pH-gradienter. Protongradienten inuti lysosomerna upprätthåller ett pH lägre än cytoplasman. Vid normalt fysiologiskt pH presenterar NR en nettoladdning på ungefär noll, vilket gör det möjligt att penetrera cellmembran. Således blir färgämnet laddat och behålls inuti lysosomerna. Följaktligen, ju större mängden kvarhållen NR, desto större är antalet viabla celler14. Kemiska ämnen som skadar cellytan eller lysosomala membran försämrar upptaget av detta färgämne.

CFDA-AM-analysen är en fluorometrisk cellviabilitetsanalys baserad på retention av 5-karboxifluoresceindiacetatacetoximetylester (CFDA-AM)15. 5-CFDA-AM, ett esterassubstrat, omvandlas till karboxifluorescein, en fluorescerande substans som är polär och icke-permeabel genom membran av levande celler15; Således behålls den i insidan av ett intakt cellmembran, vilket indikerar livskraftiga celler.

Nyligen kombinerades tre cytotoxicitetsanalyser (CFDA-AM, NR och AB-analyser) i en validerad ISO-riktlinje (International Organization for Standardization) (ISO 21115:2019)16 och OECD (Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling) testmetod (OECD TG 249) för att utvärdera akut toxicitet hos fisk med hjälp av RTgill-W1-cellinjen (permanent cellinje från regnbåge [Oncorhynchus mykiss] gill) i 24-brunnsplattor17 . Även om det finns en befintlig cellbaserad metod för att förutsäga akut toxicitet hos fisk har ansträngningar gjorts för att utveckla liknande metoder med andra fiskarter och öka metodens genomströmning. Några exempel är utvecklingen av ZFL-cellinjer transfekterade med rapportgener för specifika toxicitetsvägar18,19, fototoxicitetstester i RTgill-W1-cellinjen 20 och användningen av ZFL- och ZF4-cellinjer (zebrafisk fibroblastisk härledd från 1 dag gamla embryon) för att bedöma toxicitet genom flera cytotoxicitetsanalyser21.

Danio rerio (zebrafisk) är en av de viktigaste fiskarterna som används i akvatiska toxicitetsstudier. Således kan cellbaserade metoder med zebrafiskcellinjer för testning av toxicitet på fisk vara extremt användbara. ZFL-cellinjen är en zebrafiskepitelial hepatocytcellinje som presenterar de viktigaste egenskaperna hos leverparenkymala celler och kan metabolisera xenobiotika 7,22,23,24,25. Under tiden är ZEM2S-cellinjen en embryonal zebrafiskfibroblastisk cellinje härledd från blastulastadiet som kan användas för att undersöka utvecklingseffekter på fisk26,27. Således beskriver detta protokoll fyra cytotoxicitetsanalyser (MTT-, AB-, NR- och CFDA-AM-analyser), med modifieringar som ska utföras med ZFL- och ZEM2S-cellinjer i 96-brunnsplattor.

Protocol

OBS: Se materialförteckningen för listan över material som används i detta protokoll och tabell 1 för sammansättningen av lösningar och medier som används i detta protokoll. 1. Förbereda ZFL- och ZEM2S-celler Börja med en T75-kolv med ZFL- eller ZEM2S-celler med 80 % sammanflöde, odlad i respektive komplett medium vid 28 °C utan CO2. Ta bort odlingsmediet från kolven och tvätta cellerna genom att ti…

Representative Results

Figur 3 visar plattorna i AB-, CFDA-AM-, NR- och MTT-analyserna. För AB-analysen (figur 3A) visar de tomma brunnarna och brunnarna med inget eller ett minskat antal viabla celler blå färg och låg fluorescens, medan brunnarna med ett stort antal livskraftiga celler är rosa och uppvisar höga fluorescensvärden på grund av omvandlingen av resazurin (AB) till resorufin (rosa substans) av de viabla cellerna. För CFDA-AM-analysen finns det ingen synlig skillna…

Discussion

Cytotoxicitetsanalyser används ofta för in vitro-toxicitetsutvärdering, och denna protokollartikel presenterar fyra vanliga cytotoxicitetsanalyser modifierade för att utföras i zebrafiskcellinjer (dvs. celldensitet för 96-brunnsplatta, inkubationstid i MTT-analysen, FBS-utarmning under det kemiska exponeringstillståndet och maximal acceptabel koncentration för SC). Eftersom dessa analyser kvantifierar cytotoxicitet med olika slutpunkter för cellviabilitet (metabolisk funktion, lysosomal membranintegrite…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Till minne av Dr. Márcio Lorencini, medförfattare till detta arbete, en utmärkt forskare inom kosmetikområdet och ägnad åt att främja kosmetisk forskning i Brasilien. Författarna är tacksamma för Multi-user Laboratory i fysiologiska avdelningen (UFPR) för tillgänglighet av utrustning och för ekonomiskt stöd från Coordination for the Improvement of Higher Education Personnel (CAPES, Brasilien) (Finance Code 001) och Grupo Boticario.

Materials

5-CFDA, AM (5-Carboxyfluorescein Diacetate, Acetoxymethyl Ester) Invitrogen C1345
Cell culture plate, 96 well plate Sarstedt 83.3924 Surface: Standard, flat base
DMEM Gibco 12800-017 Powder, high glucose, pyruvate
Ham's F-12 Nutrient Mix, powder Gibco 21700026 Powder
HEPES (1 M) Gibco 15630080
Leibovitz's L-15 Medium Gibco 41300021 Powder
Neutral red  Sigma-Aldrich N4638 Powder, BioReagent, suitable for cell culture
Orbital shaker  Warmnest KLD-350-BI 22 mm rotation diameter
Dulbeccos PBS (10X) with calcium and magnesium Invitrogen 14080055
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122
Resazurin sodium salt  Sigma-Aldrich R7017 Powder, BioReagent, suitable for cell culture
RPMI 1640 Medium Gibco 31800-014 Powder
SFB – Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions Gibco 12657-029
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 Powder,  bioreagent for molecular biology
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide  98% Sigma-Aldrich M2128
Trypan blue stain (0.4%) Gibco 15250-061
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red Gibco 15400054
ZEM2S cell line ATCC CRL-2147 This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J.
Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA)
ZFL cell line BCRJ 256
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. ECHA. Non-Animal Approaches-Current Status of Regulatory Applicability Under the REACH, CLP and Biocidal Products Regulations. ECHA. , (2017).
  2. Alternative Methods Accepted by US Agencies. National Toxicology Program, and US Department of Health and Human Services Available from: https://ntp.niehs.nih.gov/whatwestudy/niceatm/accept-methods/index.html (2022)
  3. Schirmer, K. Proposal to improve vertebrate cell cultures to establish them as substitutes for the regulatory testing of chemicals and effluents using fish. Toxicology. 224 (3), 163-183 (2006).
  4. Scholz, S., et al. Alternatives to in vivo tests to detect endocrine disrupting chemicals (EDCs) in fish and amphibians-screening for estrogen, androgen and thyroid hormone disruption. Critical Reviews in Toxicology. 43 (1), 45-72 (2013).
  5. Tanneberger, K., et al. Predicting fish acute toxicity using a fish gill cell line-based toxicity assay. Environmental Science & Technology. 47 (2), 1110-1119 (2013).
  6. Roesler, R., Lorencini, M., Pastore, G. Brazilian cerrado antioxidant sources: cytotoxicity and phototoxicity in vitro. Food Science and Technology. 30, 814-821 (2010).
  7. Ruyra, A., et al. Zebrafish liver (ZFL) cells are able to mount an anti-viral response after stimulation with Poly (I:C). Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 182, 55-63 (2015).
  8. Natsch, A., Laue, H., Haupt, T., von Niederhäusen, V., Sanders, G. Accurate prediction of acute fish toxicity of fragrance chemicals with the RTgill-W1 cell assay. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (3), 931-941 (2018).
  9. Freshney, R. I. Cytotoxicity. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. , (2005).
  10. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  11. O’Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. European Journal of Biochemistry. 267 (17), 5421-5426 (2000).
  12. Gonzalez, R. J., Tarloff, J. B. Evaluation of hepatic subcellular fractions for Alamar blue and MTT reductase activity. Toxicology In Vitro. 15 (3), 257-259 (2001).
  13. Borenfreund, E., Puerner, J. A. Toxicity determined in vitro by morphological alterations and neutral red absorption. Toxicology Letters. 24 (2-3), 119-124 (1985).
  14. Repetto, G., del Peso, A., Zurita, J. L. Neutral red uptake assay for the estimation of cell viability/cytotoxicity. Nature Protocols. 3 (7), 1125-1131 (2008).
  15. Kamiloglu, S., Sari, G., Ozdal, T., Capanoglue, E. Guidelines for cell viability assays. Food Frontiers. 1 (3), 332-349 (2020).
  16. Water Quality-Determination of Acute Toxicity of Water Samples and Chemicals to a Fish Gill Cell Line (RTgill-W1) (ISO 21115:2019). International Organization for Standardization Available from: https://www.iso.org/standar/69933.html (2019)
  17. Organisation for Economic Co-operation and Development. . Test Guideline No. 249: Fish Cell Line Acute Toxicity-The RTgill-W1 Cell Line Assay. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. Effects on Biotic Systems. , (2021).
  18. Lungu-Mitea, S., Lundqvist, J. Potentials and pitfalls of transient in vitro reporter bioassays: interference by vector geometry and cytotoxicity in recombinant zebrafish cell lines. Archives of Toxicology. 94 (8), 2769-2784 (2020).
  19. Lungu-Mitea, S., Han, Y., Lundqvist, J. Development, scrutiny, and modulation of transient reporter gene assays of the xenobiotic metabolism pathway in zebrafish hepatocytes. Cell Biology and Toxicology. , 1-23 (2021).
  20. Schirmer, K., Chan, A. G., Greenberg, B. M., Dixon, D. G., Bols, N. C. Methodology for demonstrating and measuring the photocytotoxicity of fluoranthene to fish cells in culture. Toxicology In Vitro. 11 (1-2), 107-119 (1997).
  21. Lungu-Mitea, S., et al. Modeling bioavailable concentrations in zebrafish cell lines and embryos increases the correlation of toxicity potencies across test systems. Environmental Science & Technology. 55 (1), 447-457 (2021).
  22. Cavalcante, D. G. S. M., et al. Cytotoxic, biochemical and genotoxic effects of biodiesel produced by different routes on ZFL cell line. Toxicology In Vitro. 28 (6), 1117-1125 (2014).
  23. Meng, Q., Yeung, K., Chan, K. M. Toxic effects of octocrylene on zebrafish larvae and liver cell line (ZFL). Aquatic Toxicology. 236, 105843 (2021).
  24. Kwok, M. L., Chan, K. M. Oxidative stress and apoptotic effects of copper and cadmium in the zebrafish liver cell line ZFL. Toxicology Reports. 7, 822-835 (2020).
  25. Yang, J., Chan, K. M. Evaluation of the toxic effects of brominated compounds (BDE-47, 99, 209, TBBPA) and bisphenol A (BPA) using a zebrafish liver cell line, ZFL. Aquatic Toxicology. 159, 138-147 (2015).
  26. Bradford, C. S., Sun, L., Collodi, P., Barnes, D. W. Cell cultures from zebrafish embryos and adult tissues. Journal of Tissue Culture Methods. 16 (2), 99-107 (1994).
  27. He, S., et al. Genetic and transcriptome characterization of model zebrafish cell lines. Zebrafish. 3 (4), 441-453 (2006).
  28. Mansoury, M., Hamed, M., Karmustaji, R., Al Hannan, F., Safrany, S. T. The edge effect: A global problem. The trouble with culturing cells in 96-well plates. Biochemistry and Biophysics Reports. 26, 100987 (2021).
  29. Funk, D., Schrenk, H. -. H., Frei, E. Serum albumin leads to false-positive results in the XTT and the MTT assay. BioTechniques. 43 (2), 178 (2007).
  30. Dayeh, V. R., Bols, N. C., Tanneberger, K., Schirmer, K., Lee, L. E. J. The use of fish-derived cell lines for investigation of environmental contaminants: An update following OECD’s fish toxicity testing framework no. 171. Current Protocols in Toxicology. 1, (2013).
  31. Stepanenko, A. A., Dmitrenko, V. V. Pitfalls of the MTT assay: Direct and off-target effects of inhibitors can result in over/underestimation of cell viability. Gene. 574 (2), 193-203 (2015).
  32. Ulukaya, E., Colakogullari, M., Wood, E. J. Interference by anti-cancer chemotherapeutic agents in the MTT-tumor chemosensitivity assay. Chemotherapy. 50 (1), 43-50 (2004).
  33. Sebaugh, J. L. Guidelines for accurate EC50/IC50 estimation. Pharmaceutical Statistics. 10 (2), 128-134 (2011).
  34. Weimer, M., et al. The impact of data transformations on concentration-response modeling. Toxicology Letters. 213 (2), 292-298 (2012).
  35. Green, J. W., Holbech, T. A., Henrik, Chapter 4: Analysis of Continuous Data (Regression). Statistical Analysis of Ecotoxicity Studies. , (2018).
  36. Proença, S., et al. Effective exposure of chemicals in in vitro cell systems: A review of chemical distribution models. Toxicology In Vitro. 73, 105133 (2021).
  37. Guidony, N. S., et al. ABC proteins activity and cytotoxicity in zebrafish hepatocytes exposed to triclosan. Environmental Pollution. 271, 116368 (2021).
  38. da Silva, N. D. G., et al. Interference of goethite in the effects of glyphosate and Roundup® on ZFL cell line. Toxicology In Vitro. 65, 104755 (2020).
  39. Yang, Y., et al. Temperature is a key factor influencing the invasion and proliferation of Toxoplasma gondii in fish cells. Experimental Parasitology. 217, 107966 (2020).
  40. Lopes, F. M., Sandrini, J. Z., Souza, M. M. Toxicity induced by glyphosate and glyphosate-based herbicides in the zebrafish hepatocyte cell line (ZF-L). Ecotoxicology and Environmental Safety. 162, 201-207 (2018).
  41. Lachner, D., Oliveira, L. F., Martinez, C. B. R. Effects of the water soluble fraction of gasoline on ZFL cell line: Cytotoxicity, genotoxicity and oxidative stress. Toxicology In Vitro. 30, 225-230 (2015).
  42. Morozesk, M., et al. Effects of multiwalled carbon nanotubes co-exposure with cadmium on zebrafish cell line: Metal uptake and accumulation, oxidative stress, genotoxicity and cell cycle. Ecotoxicology and Environmental Safety. 202, 110892 (2020).
  43. Dognani, G., et al. Nanofibrous membranes for low-concentration Cr VI adsorption: kinetic, thermodynamic and the influence on ZFL cells viability. Materials Research. , 24 (2021).
  44. ZEM2S (ATCC®CRL-2147™). American Type Culture Collection Available from: https://www.atcc.org/products/crl-2147 (2023)
  45. Chen, Y., et al. Acute toxicity of the cationic surfactant C12-benzalkonium in different bioassays: how test design affects bioavailability and effect concentrations. Environmental Toxicology and Chemistry. 33 (3), 606-615 (2014).
  46. Pomponio, G., et al. In vitro kinetics of amiodarone and its major metabolite in two human liver cell models after acute and repeated treatments. Toxicology In Vitro. 30, 36-51 (2015).
  47. Mori, M., Wakabayashi, M. Cytotoxicity evaluation of chemicals using cultured fish cells. Water Science and Technology. 42 (7-8), 277-282 (2000).
  48. Caminada, D., Escher, C., Fent, K. Cytotoxicity of pharmaceuticals found in aquatic systems: comparison of PLHC-1 and RTG-2 fish cell lines. Aquatic Toxicology. 79 (2), 114-123 (2006).
  49. Giltrap, M., et al. In vitro screening of organotin compounds and sediment extracts for cytotoxicity to fish cells. Environmental Toxicology and Chemistry. 30 (1), 154-161 (2011).
  50. Hollert, H., Duerr, M., Erdinger, L., Braunbeck, T. Cytotoxicity of settling particulate matter and sediments of the Neckar River (Germany) during a winter flood. Environmental Toxicology and Chemistry. 19 (3), 528-534 (2000).
  51. Pannetier, P., et al. Toxicity assessment of pollutants sorbed on environmental sample microplastics collected on beaches: Part I-adverse effects on fish cell line. Environmental Pollution. 248, 1088-1097 (2019).
  52. Ternjej, I., Srček, V. G., Mihaljević, Z., Kopjar, N. Cytotoxic and genotoxic effects of water and sediment samples from gypsum mining area in channel catfish ovary (CCO) cells. Ecotoxicology and Environmental Safety. 98, 119-127 (2013).
  53. Hamid, R., Rotshteyn, Y., Rabadi, L., Parikh, R., Bullock, P. Comparison of alamar blue and MTT assays for high throughput screening. Toxicology In Vitro. 18 (5), 703-710 (2004).
  54. Vistica, D. T., et al. Tetrazolium-based assays for cellular viability: a critical examination of selected parameters affecting formazan production. Investigación sobre el cáncer. 51 (10), 2515-2520 (1991).
  55. Knauer, K., Lampert, C., Gonzalez-Valero, J. Comparison of in vitro and in vivo acute fish toxicity in relation to toxicant mode of action. Chemosphere. 68 (8), 1435-1441 (2007).
  56. Stadnicka-Michalak, J., Tanneberger, K., Schirmer, K., Ashauer, R. Measured and modeled toxicokinetics in cultured fish cells and application to in vitro-in vivo toxicity extrapolation. PLoS One. 9 (3), 92303 (2014).

Tags

Cytotoxicity AssayZebrafish Cell LinesZEM2SZFL96-well PlateCell ViabilityAcute ToxicityEcotoxicityAlternative Fish AssaysHepatocytesEmbryonic CellsCell SuspensionMulti-channel PipetteTest ChemicalsTriton X-100Exposure Media

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Rodrigues de Souza, I., Wilke Sivek, T., Vaz de Oliveira, J. B., Di Pietro Micali Canavez, A., de Albuquerque Vita, N., Cigaran Schuck, D., Rodrigues de Souza, I., Cestari, M. M., Lorencini, M., Leme, D. M. Cytotoxicity Assays with Zebrafish Cell Lines. J. Vis. Exp. (191), e64860, doi:10.3791/64860 (2023).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image