Essais de cytotoxicité avec des lignées cellulaires de poisson zèbre

Les substances chimiques doivent être testées en ce qui concerne leur sécurité pour la santé humaine et l’environnement. Les biomarqueurs moléculaires et cellulaires sont de plus en plus pris en compte dans les évaluations de l’innocuité pour prédire les effets sur les organismes vivants par les organismes de réglementation et/ou les lois (p. ex. REACH, OCDE, US EPA)^1,2, car ils peuvent précéder le résultat indésirable in vivo (p. ex. perturbation endocrinienne, réponse immunologique, toxicité aiguë, phototoxicité)3,4,5,6,7 . Dans ce contexte, la cytotoxicité a été prise comme mesure pour prédire la toxicité aiguë chez les poissons ^5,8; Cependant, il peut avoir de nombreuses autres applications dans les études d’écotoxicité, telles que la définition des concentrations sous-cytotoxiques de substances chimiques pour étudier leur ensemble le plus diversifié d’effets sur les poissons (par exemple, les effets perturbateurs endocriniens).

Dans les systèmes de culture cellulaire (systèmes in vitro ), la cytotoxicité des substances chimiques peut être déterminée par des méthodes différentes selon les types de paramètres. Par exemple, une méthode de cytotoxicité peut être basée sur un paramètre lié à la morphologie spécifique observée au cours du processus de mort cellulaire, tandis qu’une autre peut déterminer la cytotoxicité par la mesure de la mort, de la viabilité et de la fonctionnalité cellulaires, de la morphologie, du métabolisme énergétique et de la fixation et de la prolifération cellulaires. Les substances chimiques peuvent affecter la viabilité cellulaire par différents mécanismes, de sorte qu’une évaluation de la cytotoxicité couvrant différents paramètres de viabilité cellulaire est nécessaire pour prédire les effets chimiques⁹.

MTT et Alamar Blue (AB) sont des tests qui déterminent les effets sur la viabilité cellulaire en fonction de l’activité métabolique cellulaire. Le test MTT évalue l’activité de l’enzyme mitochondriale succinate déshydrogénase¹⁰. La réduction du bromure jaunâtre de 3-[4,5-diméthylthiazol-2yl]-2,5-diphényltétrazolium (MTT) en bleu de formazan ne se produit que dans les cellules viables, et sa densité optique est directement proportionnelle au nombre de cellules viables¹⁰. Le test AB est un indicateur sensible d’oxydoréduction médié par des enzymes mitochondriales qui deviennent fluorescentes et changent de couleur lors de la réduction de la résazurine en résorunine par les cellules vivantes¹¹; cependant, les enzymes cytosoliques et microsomiques contribuent également à la réduction de AB et MTT¹². Ces enzymes peuvent inclure plusieurs réductases, telles que l’alcool et l’aldéhyde oxydoréductases, la NAD(P)H: quinone oxydoréductase, la flavine réductase, la NADH déshydrogénase et les cytochromes¹¹.

Le test Neutral Red (NR) est un test de viabilité cellulaire basé sur l’incorporation de ce colorant dans les lysosomes de cellules viables¹³. L’absorption de NR dépend de la capacité des cellules à maintenir les gradients de pH. Le gradient de protons à l’intérieur des lysosomes maintient un pH inférieur à celui du cytoplasme. À pH physiologique normal, le NR présente une charge nette d’environ zéro, ce qui lui permet de pénétrer dans les membranes cellulaires. Ainsi, le colorant se charge et est retenu à l’intérieur des lysosomes. Par conséquent, plus la quantité de NR retenue est importante, plus le nombre de cellules viables¹⁴ est élevé. Les substances chimiques qui endommagent la surface cellulaire ou les membranes lysosomales nuisent à l’absorption de ce colorant.

Le test CFDA-AM est un test de viabilité cellulaire fluorométrique basé sur la rétention de l’ester d’acétoxyméthyle de diacétate de 5-carboxyfluorescéine (CFDA-AM)¹⁵. Le 5-CFDA-AM, un substrat d’estérase, est converti en carboxyfluorescéine, une substance fluorescente polaire et non perméable par les membranes des cellules vivantes¹⁵ ; Ainsi, il est retenu dans la face interne d’une membrane cellulaire intacte, indiquant des cellules viables.

Récemment, trois essais de cytotoxicité (essais CFDA-AM, NR et AB) ont été combinés dans une ligne directrice validée ISO (Organisation internationale de normalisation) (ISO 21115:2019)¹⁶ et une méthode d’essai de l’OCDE (OCDE TG 249) pour évaluer la toxicité aiguë des poissons à l’aide de la lignée cellulaire RTgill-W1 (lignée cellulaire permanente de truite arc-en-ciel [Oncorhynchus mykiss] branchie) dans des plaques à 24 puits¹⁷ . Bien qu’il existe une méthode cellulaire pour prédire la toxicité aiguë des poissons, des efforts ont été investis dans le développement de méthodes similaires avec d’autres espèces de poissons et l’augmentation du débit de la méthode. Quelques exemples incluent le développement de lignées cellulaires ZFL transfectées avec des gènes rapporteurs pour des voies de toxicité spécifiques^18,19, des tests de phototoxicité dans la lignée cellulaire RTgill-W1 20 et l’utilisation de lignées cellulaires ZFL et ZF4 (poisson zèbre fibroblastique dérivé d’embryons âgés de 1 jour) pour évaluer la toxicité par plusieurs tests de cytotoxicité²¹.

Danio rerio (poisson zèbre) est l’une des principales espèces de poissons utilisées dans les études de toxicité aquatique; Ainsi, les méthodes cellulaires avec des lignées cellulaires de poisson zèbre pour les tests de toxicité des poissons peuvent être extrêmement utiles. La lignée cellulaire ZFL est une lignée cellulaire hépatocytes épithéliales de poisson zèbre qui présente les principales caractéristiques des cellules parenchymateuses du foie et peut métaboliser les xénobiotiques 7,22,23,24,25. Pendant ce temps, la lignée cellulaire ZEM2S est une lignée cellulaire fibroblastique embryonnaire de poisson zèbre dérivée du stade blastula qui peut être utilisée pour étudier les effets sur le développement des poissons^26,27. Ainsi, ce protocole décrit quatre tests de cytotoxicité (tests MTT, AB, NR et CFDA-AM), avec des modifications à effectuer avec des lignées cellulaires ZFL et ZEM2S dans des plaques à 96 puits.