JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Traducción Automática
Medio ambiente

Cytotoksisitetsanalyser med sebrafiskcellelinjer

Published: January 06, 2023
doi:
10.3791/64860
, , , , , , , , ,
1Graduate Program in Genetics, Department of Genetics,Federal University of Paraná (UFPR), 2Safety of Product Department,Grupo Boticário, 3Department of Genetics,Federal University of Paraná (UFPR)

Summary

Denne protokollen presenterer ofte brukte cytotoksisitetsanalyser (Alamar Blue [AB], CFDA-AM, Neutral Red og MTT assays) tilpasset for vurdering av cytotoksisitet i sebrafiskembryo (ZEM2S) og lever (ZFL) cellelinjer i 96-brønnplater.

Abstract

Fiskecellelinjer har blitt stadig mer brukt i økotoksisitetsstudier, og cytotoksisitetsanalyser har blitt foreslått som metoder for å forutsi akutt toksisitet hos fisk. Dermed presenterer denne protokollen cytotoksisitetsanalyser modifisert for å evaluere cellelevedyktighet i sebrafisk (Danio rerio) embryo (ZEM2S) og lever (ZFL) cellelinjer i 96-brønnsplater. De evaluerte cytotoksisitetsendepunktene er mitokondriell integritet (Alamar Blue [AB] og MTT-analyser), membranintegritet via esteraseaktivitet (CFDA-AM-analyse) og lysosomal membranintegritet (Neutral Red [NR] assay). Etter eksponering av teststoffene i en 96-brønnplate utføres cytotoksisitetsanalysene; Her utføres AB og CFDA-AM samtidig, etterfulgt av NR på samme plate, mens MTT-analysen utføres på en egen plate. Avlesningene for disse analysene tas ved fluorescens for AB og CFDA-AM, og absorbans for MTT og NR. Cytotoksisitetsanalysene utført med disse fiskecellelinjene kan brukes til å studere akutt giftighet av kjemiske stoffer på fisk.

Introduction

Kjemiske stoffer må testes med hensyn til sikkerhet for menneskers helse og miljøet. Molekylære og cellulære biomarkører har i økende grad blitt vurdert i sikkerhetsvurderinger for å forutsi effekter på levende organismer av reguleringsorganer og/eller lovgivning (f.eks. REACH, OECD, US EPA)1,2, siden de kan komme før in vivo bivirkningsutfall (f.eks. hormonforstyrrelser, immunologisk respons, akutt toksisitet, fototoksisitet)3,4,5,6,7 . I denne sammenheng er cytotoksisitet tatt som en måling for å forutsi fisk akutt toksisitet 5,8; Det kan imidlertid ha mange andre anvendelser i økotoksisitetsstudier, for eksempel å definere subcytotoksiske konsentrasjoner av kjemiske stoffer for å studere deres mest varierte sett med effekter på fisk (f.eks. Hormonforstyrrende effekter).

I cellekultursystemer (in vitro-systemer ) kan cytotoksisiteten til kjemiske stoffer bestemmes ved metoder som varierer i typer endepunkter. For eksempel kan en cytotoksisitetsmetode være basert på et endepunkt relatert til spesifikk morfologi observert under celledødsprosessen, mens en annen kan bestemme cytotoksisitet ved måling av celledød, levedyktighet og funksjonalitet, morfologi, energimetabolisme og cellevedlegg og proliferasjon. Kjemiske stoffer kan påvirke cellenes levedyktighet gjennom forskjellige mekanismer, og cytotoksisitetsvurdering som dekker forskjellige cellelevedyktighetsendepunkter er derfor nødvendig for å forutsi kjemiske effekter9.

MTT og Alamar Blue (AB) er analyser som bestemmer effekter på cellenes levedyktighet basert på cellemetabolsk aktivitet. MTT-analysen evaluerer aktiviteten til mitokondrieenzymet succinat dehydrogenase10. Reduksjonen av gulaktig 3-[4,5-dimetyltiazol-2yl]-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) til formazanblå forekommer bare i levedyktige celler, og dens optiske tetthet er direkte proporsjonal med antall levedyktige celler10. AB-analysen er en sensitiv oksidasjonsreduksjonsindikator, mediert av mitokondrielle enzymer som fluorescerer og endrer farge ved reduksjon av resazurin til resorufin av levende celler11; Imidlertid bidrar cytosoliske og mikrosomale enzymer også til reduksjon av AB og MTT12. Disse enzymene kan omfatte flere reduktaser, slik som alkohol og aldehydoksidoreduktaser, NAD (P) H: kinon oksidoreduktase, flavin reduktase, NADH dehydrogenase og cytokromer11.

Den nøytrale røde (NR) analysen er en celle levedyktighetsanalyse basert på inkorporering av dette fargestoffet i lysosomene til levedyktige celler13. Opptaket av NR avhenger av cellens kapasitet til å opprettholde pH-gradienter. Protongradienten inne i lysosomene opprettholder en pH lavere enn cytoplasma. Ved normal fysiologisk pH presenterer NR en nettoladning på omtrent null, noe som gjør det mulig å trenge inn i cellemembraner. Dermed blir fargestoffet ladet og beholdes inne i lysosomene. Følgelig, jo større mengde beholdt NR, jo større antall levedyktige celler14. Kjemiske stoffer som skader celleoverflaten eller lysosomale membraner, svekker opptaket av dette fargestoffet.

CFDA-AM-analysen er en fluorometrisk cellelevedyktighetsanalyse basert på retensjon av 5-karboksyfluoresceindiacetatacetoksymetylester (CFDA-AM)15. 5-CFDA-AM, et esterasesubstrat, omdannes til karboksyfluorescein, et fluorescerende stoff som er polært og ikke-permeabelt av membraner av levende celler15; Dermed beholdes den på innsiden av en intakt cellemembran, noe som indikerer levedyktige celler.

Nylig ble tre cytotoksisitetsanalyser (CFDA-AM-, NR- og AB-analyser) kombinert i en validert ISO (International Organization for Standardization) retningslinje (ISO 21115: 2019) 16 og OECD (Organisasjonen for økonomisk samarbeid og utvikling) testmetode (OECD TG 249) for å evaluere fisk akutt toksisitet ved bruk av RTgill-W1 cellelinje (permanent cellelinje fra regnbueørret [Oncorhynchus mykiss] gill) i 24-brønns plater17 . Selv om det finnes en eksisterende cellebasert metode for å forutsi akutt giftighet hos fisk, er det lagt ned arbeid i å utvikle lignende metoder med andre fiskearter og øke gjennomstrømningen av metoden. Noen eksempler inkluderer utvikling av ZFL-cellelinjer transfeksjonert med reportergener for spesifikke toksisitetsveier18,19, fototoksisitetstester i RTgill-W1-cellelinjen 20, og bruk av ZFL- og ZF4-cellelinjer (sebrafiskfibroblastisk avledet fra 1 dag gamle embryoer) for å vurdere toksisitet ved flere cytotoksisitetsanalyser21.

Danio rerio (sebrafisk) er en av de viktigste fiskeartene som brukes i akvatiske toksisitetsstudier; Dermed kan cellebaserte metoder med sebrafiskcellelinjer for fisketoksisitetstesting være ekstremt nyttige. ZFL-cellelinjen er en sebrafiskepitelial hepatocyttcellelinje som presenterer de viktigste egenskapene til leverparenkymale celler og kan metabolisere xenobiotika 7,22,23,24,25. I mellomtiden er ZEM2S-cellelinjen en embryonal sebrafisk fibroblastisk cellelinje avledet fra blastulastadiet som kan brukes til å undersøke utviklingseffekter på fisk26,27. Dermed beskriver denne protokollen fire cytotoksisitetsanalyser (MTT-, AB-, NR- og CFDA-AM-analyser), med modifikasjoner som skal utføres med ZFL- og ZEM2S-cellelinjer i 96-brønnsplater.

Protocol

MERK: Se materialfortegnelsen for listen over materialer som brukes i denne protokollen og tabell 1 for sammensetningen av løsninger og medier som brukes i denne protokollen. 1. Klargjøre ZFL- og ZEM2S-celler Start med en T75-kolbe av ZFL- eller ZEM2S-celler med 80 % samløp, dyrket i det respektive komplette medium ved 28 °C uten CO2. Fjern dyrkningsmediet fra kolben og vask cellene ved å tilsette 10 ml 1x f…

Representative Results

Figur 3 viser platene til AB-, CFDA-AM-, NR- og MTT-analysene. For AB-analysen (figur 3A) viser de blanke brønnene og brønnene med ingen eller et redusert antall levedyktige celler blå farge og lav fluorescens, mens brønnene med et høyt antall levedyktige celler er rosa og presenterer høye fluorescensverdier på grunn av transformasjonen av resazurin (AB) til resorufin (rosa substans) av levedyktige celler. For CFDA-AM-analysen er det ingen synlig forskjel…

Discussion

Cytotoksisitetsanalyser er mye brukt for in vitro toksisitetsevaluering, og denne protokollartikkelen presenterer fire vanlige cytotoksisitetsanalyser modifisert for å bli utført i sebrafiskcellelinjer (dvs. celletetthet for 96-brønnplate, inkubasjonstid i MTT-analysen, FBS-uttømming under kjemisk eksponeringstilstand og maksimal akseptabel konsentrasjon for SC). Da disse analysene kvantifiserer cytotoksisitet ved forskjellige cellelevedyktighetsendepunkter (metabolsk funksjon, lysosomal membranintegritet og…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Til minne om Dr. Márcio Lorencini, en medforfatter av dette arbeidet, en utmerket forsker innen kosmetikk og viet til å fremme kosmetisk forskning i Brasil. Forfatterne er takknemlige for flerbrukerlaboratoriet i fysiologisk avdeling (UFPR) for tilgjengelighet av utstyr og for økonomisk støtte fra koordineringen for forbedring av høyere utdanningspersonell (CAPES, Brasil) (finanskode 001) og Grupo Boticario.

Materials

5-CFDA, AM (5-Carboxyfluorescein Diacetate, Acetoxymethyl Ester) Invitrogen C1345
Cell culture plate, 96 well plate Sarstedt 83.3924 Surface: Standard, flat base
DMEM Gibco 12800-017 Powder, high glucose, pyruvate
Ham's F-12 Nutrient Mix, powder Gibco 21700026 Powder
HEPES (1 M) Gibco 15630080
Leibovitz's L-15 Medium Gibco 41300021 Powder
Neutral red  Sigma-Aldrich N4638 Powder, BioReagent, suitable for cell culture
Orbital shaker  Warmnest KLD-350-BI 22 mm rotation diameter
Dulbeccos PBS (10X) with calcium and magnesium Invitrogen 14080055
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122
Resazurin sodium salt  Sigma-Aldrich R7017 Powder, BioReagent, suitable for cell culture
RPMI 1640 Medium Gibco 31800-014 Powder
SFB – Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions Gibco 12657-029
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 Powder,  bioreagent for molecular biology
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide  98% Sigma-Aldrich M2128
Trypan blue stain (0.4%) Gibco 15250-061
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red Gibco 15400054
ZEM2S cell line ATCC CRL-2147 This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J.
Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA)
ZFL cell line BCRJ 256
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. ECHA. Non-Animal Approaches-Current Status of Regulatory Applicability Under the REACH, CLP and Biocidal Products Regulations. ECHA. , (2017).
  2. Alternative Methods Accepted by US Agencies. National Toxicology Program, and US Department of Health and Human Services Available from: https://ntp.niehs.nih.gov/whatwestudy/niceatm/accept-methods/index.html (2022)
  3. Schirmer, K. Proposal to improve vertebrate cell cultures to establish them as substitutes for the regulatory testing of chemicals and effluents using fish. Toxicology. 224 (3), 163-183 (2006).
  4. Scholz, S., et al. Alternatives to in vivo tests to detect endocrine disrupting chemicals (EDCs) in fish and amphibians-screening for estrogen, androgen and thyroid hormone disruption. Critical Reviews in Toxicology. 43 (1), 45-72 (2013).
  5. Tanneberger, K., et al. Predicting fish acute toxicity using a fish gill cell line-based toxicity assay. Environmental Science & Technology. 47 (2), 1110-1119 (2013).
  6. Roesler, R., Lorencini, M., Pastore, G. Brazilian cerrado antioxidant sources: cytotoxicity and phototoxicity in vitro. Food Science and Technology. 30, 814-821 (2010).
  7. Ruyra, A., et al. Zebrafish liver (ZFL) cells are able to mount an anti-viral response after stimulation with Poly (I:C). Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 182, 55-63 (2015).
  8. Natsch, A., Laue, H., Haupt, T., von Niederhäusen, V., Sanders, G. Accurate prediction of acute fish toxicity of fragrance chemicals with the RTgill-W1 cell assay. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (3), 931-941 (2018).
  9. Freshney, R. I. Cytotoxicity. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. , (2005).
  10. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  11. O’Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. European Journal of Biochemistry. 267 (17), 5421-5426 (2000).
  12. Gonzalez, R. J., Tarloff, J. B. Evaluation of hepatic subcellular fractions for Alamar blue and MTT reductase activity. Toxicology In Vitro. 15 (3), 257-259 (2001).
  13. Borenfreund, E., Puerner, J. A. Toxicity determined in vitro by morphological alterations and neutral red absorption. Toxicology Letters. 24 (2-3), 119-124 (1985).
  14. Repetto, G., del Peso, A., Zurita, J. L. Neutral red uptake assay for the estimation of cell viability/cytotoxicity. Nature Protocols. 3 (7), 1125-1131 (2008).
  15. Kamiloglu, S., Sari, G., Ozdal, T., Capanoglue, E. Guidelines for cell viability assays. Food Frontiers. 1 (3), 332-349 (2020).
  16. Water Quality-Determination of Acute Toxicity of Water Samples and Chemicals to a Fish Gill Cell Line (RTgill-W1) (ISO 21115:2019). International Organization for Standardization Available from: https://www.iso.org/standar/69933.html (2019)
  17. Organisation for Economic Co-operation and Development. . Test Guideline No. 249: Fish Cell Line Acute Toxicity-The RTgill-W1 Cell Line Assay. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. Effects on Biotic Systems. , (2021).
  18. Lungu-Mitea, S., Lundqvist, J. Potentials and pitfalls of transient in vitro reporter bioassays: interference by vector geometry and cytotoxicity in recombinant zebrafish cell lines. Archives of Toxicology. 94 (8), 2769-2784 (2020).
  19. Lungu-Mitea, S., Han, Y., Lundqvist, J. Development, scrutiny, and modulation of transient reporter gene assays of the xenobiotic metabolism pathway in zebrafish hepatocytes. Cell Biology and Toxicology. , 1-23 (2021).
  20. Schirmer, K., Chan, A. G., Greenberg, B. M., Dixon, D. G., Bols, N. C. Methodology for demonstrating and measuring the photocytotoxicity of fluoranthene to fish cells in culture. Toxicology In Vitro. 11 (1-2), 107-119 (1997).
  21. Lungu-Mitea, S., et al. Modeling bioavailable concentrations in zebrafish cell lines and embryos increases the correlation of toxicity potencies across test systems. Environmental Science & Technology. 55 (1), 447-457 (2021).
  22. Cavalcante, D. G. S. M., et al. Cytotoxic, biochemical and genotoxic effects of biodiesel produced by different routes on ZFL cell line. Toxicology In Vitro. 28 (6), 1117-1125 (2014).
  23. Meng, Q., Yeung, K., Chan, K. M. Toxic effects of octocrylene on zebrafish larvae and liver cell line (ZFL). Aquatic Toxicology. 236, 105843 (2021).
  24. Kwok, M. L., Chan, K. M. Oxidative stress and apoptotic effects of copper and cadmium in the zebrafish liver cell line ZFL. Toxicology Reports. 7, 822-835 (2020).
  25. Yang, J., Chan, K. M. Evaluation of the toxic effects of brominated compounds (BDE-47, 99, 209, TBBPA) and bisphenol A (BPA) using a zebrafish liver cell line, ZFL. Aquatic Toxicology. 159, 138-147 (2015).
  26. Bradford, C. S., Sun, L., Collodi, P., Barnes, D. W. Cell cultures from zebrafish embryos and adult tissues. Journal of Tissue Culture Methods. 16 (2), 99-107 (1994).
  27. He, S., et al. Genetic and transcriptome characterization of model zebrafish cell lines. Zebrafish. 3 (4), 441-453 (2006).
  28. Mansoury, M., Hamed, M., Karmustaji, R., Al Hannan, F., Safrany, S. T. The edge effect: A global problem. The trouble with culturing cells in 96-well plates. Biochemistry and Biophysics Reports. 26, 100987 (2021).
  29. Funk, D., Schrenk, H. -. H., Frei, E. Serum albumin leads to false-positive results in the XTT and the MTT assay. BioTechniques. 43 (2), 178 (2007).
  30. Dayeh, V. R., Bols, N. C., Tanneberger, K., Schirmer, K., Lee, L. E. J. The use of fish-derived cell lines for investigation of environmental contaminants: An update following OECD’s fish toxicity testing framework no. 171. Current Protocols in Toxicology. 1, (2013).
  31. Stepanenko, A. A., Dmitrenko, V. V. Pitfalls of the MTT assay: Direct and off-target effects of inhibitors can result in over/underestimation of cell viability. Gene. 574 (2), 193-203 (2015).
  32. Ulukaya, E., Colakogullari, M., Wood, E. J. Interference by anti-cancer chemotherapeutic agents in the MTT-tumor chemosensitivity assay. Chemotherapy. 50 (1), 43-50 (2004).
  33. Sebaugh, J. L. Guidelines for accurate EC50/IC50 estimation. Pharmaceutical Statistics. 10 (2), 128-134 (2011).
  34. Weimer, M., et al. The impact of data transformations on concentration-response modeling. Toxicology Letters. 213 (2), 292-298 (2012).
  35. Green, J. W., Holbech, T. A., Henrik, Chapter 4: Analysis of Continuous Data (Regression). Statistical Analysis of Ecotoxicity Studies. , (2018).
  36. Proença, S., et al. Effective exposure of chemicals in in vitro cell systems: A review of chemical distribution models. Toxicology In Vitro. 73, 105133 (2021).
  37. Guidony, N. S., et al. ABC proteins activity and cytotoxicity in zebrafish hepatocytes exposed to triclosan. Environmental Pollution. 271, 116368 (2021).
  38. da Silva, N. D. G., et al. Interference of goethite in the effects of glyphosate and Roundup® on ZFL cell line. Toxicology In Vitro. 65, 104755 (2020).
  39. Yang, Y., et al. Temperature is a key factor influencing the invasion and proliferation of Toxoplasma gondii in fish cells. Experimental Parasitology. 217, 107966 (2020).
  40. Lopes, F. M., Sandrini, J. Z., Souza, M. M. Toxicity induced by glyphosate and glyphosate-based herbicides in the zebrafish hepatocyte cell line (ZF-L). Ecotoxicology and Environmental Safety. 162, 201-207 (2018).
  41. Lachner, D., Oliveira, L. F., Martinez, C. B. R. Effects of the water soluble fraction of gasoline on ZFL cell line: Cytotoxicity, genotoxicity and oxidative stress. Toxicology In Vitro. 30, 225-230 (2015).
  42. Morozesk, M., et al. Effects of multiwalled carbon nanotubes co-exposure with cadmium on zebrafish cell line: Metal uptake and accumulation, oxidative stress, genotoxicity and cell cycle. Ecotoxicology and Environmental Safety. 202, 110892 (2020).
  43. Dognani, G., et al. Nanofibrous membranes for low-concentration Cr VI adsorption: kinetic, thermodynamic and the influence on ZFL cells viability. Materials Research. , 24 (2021).
  44. ZEM2S (ATCC®CRL-2147™). American Type Culture Collection Available from: https://www.atcc.org/products/crl-2147 (2023)
  45. Chen, Y., et al. Acute toxicity of the cationic surfactant C12-benzalkonium in different bioassays: how test design affects bioavailability and effect concentrations. Environmental Toxicology and Chemistry. 33 (3), 606-615 (2014).
  46. Pomponio, G., et al. In vitro kinetics of amiodarone and its major metabolite in two human liver cell models after acute and repeated treatments. Toxicology In Vitro. 30, 36-51 (2015).
  47. Mori, M., Wakabayashi, M. Cytotoxicity evaluation of chemicals using cultured fish cells. Water Science and Technology. 42 (7-8), 277-282 (2000).
  48. Caminada, D., Escher, C., Fent, K. Cytotoxicity of pharmaceuticals found in aquatic systems: comparison of PLHC-1 and RTG-2 fish cell lines. Aquatic Toxicology. 79 (2), 114-123 (2006).
  49. Giltrap, M., et al. In vitro screening of organotin compounds and sediment extracts for cytotoxicity to fish cells. Environmental Toxicology and Chemistry. 30 (1), 154-161 (2011).
  50. Hollert, H., Duerr, M., Erdinger, L., Braunbeck, T. Cytotoxicity of settling particulate matter and sediments of the Neckar River (Germany) during a winter flood. Environmental Toxicology and Chemistry. 19 (3), 528-534 (2000).
  51. Pannetier, P., et al. Toxicity assessment of pollutants sorbed on environmental sample microplastics collected on beaches: Part I-adverse effects on fish cell line. Environmental Pollution. 248, 1088-1097 (2019).
  52. Ternjej, I., Srček, V. G., Mihaljević, Z., Kopjar, N. Cytotoxic and genotoxic effects of water and sediment samples from gypsum mining area in channel catfish ovary (CCO) cells. Ecotoxicology and Environmental Safety. 98, 119-127 (2013).
  53. Hamid, R., Rotshteyn, Y., Rabadi, L., Parikh, R., Bullock, P. Comparison of alamar blue and MTT assays for high throughput screening. Toxicology In Vitro. 18 (5), 703-710 (2004).
  54. Vistica, D. T., et al. Tetrazolium-based assays for cellular viability: a critical examination of selected parameters affecting formazan production. Investigación sobre el cáncer. 51 (10), 2515-2520 (1991).
  55. Knauer, K., Lampert, C., Gonzalez-Valero, J. Comparison of in vitro and in vivo acute fish toxicity in relation to toxicant mode of action. Chemosphere. 68 (8), 1435-1441 (2007).
  56. Stadnicka-Michalak, J., Tanneberger, K., Schirmer, K., Ashauer, R. Measured and modeled toxicokinetics in cultured fish cells and application to in vitro-in vivo toxicity extrapolation. PLoS One. 9 (3), 92303 (2014).

Tags

Cytotoxicity AssayZebrafish Cell LinesZEM2SZFL96-well PlateCell ViabilityAcute ToxicityEcotoxicityAlternative Fish AssaysHepatocytesEmbryonic CellsCell SuspensionMulti-channel PipetteTest ChemicalsTriton X-100Exposure Media

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Rodrigues de Souza, I., Wilke Sivek, T., Vaz de Oliveira, J. B., Di Pietro Micali Canavez, A., de Albuquerque Vita, N., Cigaran Schuck, D., Rodrigues de Souza, I., Cestari, M. M., Lorencini, M., Leme, D. M. Cytotoxicity Assays with Zebrafish Cell Lines. J. Vis. Exp. (191), e64860, doi:10.3791/64860 (2023).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image