JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Traducción Automática
Medio ambiente

Cytotoksicitetsanalyser med zebrafiskcellelinjer

Published: January 06, 2023
doi:
10.3791/64860
, , , , , , , , ,
1Graduate Program in Genetics, Department of Genetics,Federal University of Paraná (UFPR), 2Safety of Product Department,Grupo Boticário, 3Department of Genetics,Federal University of Paraná (UFPR)

Summary

Denne protokol præsenterer almindeligt anvendte cytotoksicitetsassays (Alamar Blue [AB], CFDA-AM, Neutral Red og MTT-assays) tilpasset til vurdering af cytotoksicitet i zebrafiskembryo (ZEM2S) og lever (ZFL) cellelinjer i 96-brøndplader.

Abstract

Fiskecellelinjer er i stigende grad blevet anvendt i økotoksicitetsundersøgelser, og cytotoksicitetsanalyser er blevet foreslået som metoder til at forudsige akut toksicitet hos fisk. Således præsenterer denne protokol cytotoksicitetsassays modificeret til evaluering af cellelevedygtighed i zebrafisk (Danio rerio), embryo (ZEM2S) og lever (ZFL) cellelinjer i 96-brøndplader. De evaluerede cytotoksicitetsendepunkter er mitokondrieintegritet (Alamar Blue [AB] og MTT-assays), membranintegritet via esteraseaktivitet (CFDA-AM-assay) og lysosomal membranintegritet (Neutral Red [NR] assay). Efter eksponering af teststofferne i en plade med 96 huller udføres cytotoksicitetsassays her udføres AB og CFDA-AM samtidigt, efterfulgt af NR på samme plade, mens MTT-analysen udføres på en separat plade. Udlæsningerne for disse assays foretages ved fluorescens for AB og CFDA-AM og absorbans for MTT og NR. De cytotoksiske assays udført med disse fiskecellelinjer kan anvendes til at undersøge den akutte toksicitet af kemiske stoffer på fisk.

Introduction

Kemiske stoffer skal testes med hensyn til deres sikkerhed for menneskers sundhed og miljøet. Molekylære og cellulære biomarkører er i stigende grad blevet taget i betragtning i sikkerhedsvurderinger for at forudsige virkninger på levende organismer af regulerende organer og/eller lovgivning (f.eks. REACH, OECD, US EPA)1,2, da de kan gå forud for in vivo-bivirkningen (f.eks. hormonforstyrrende virkninger, immunologisk respons, akut toksicitet, fototoksicitet)3,4,5,6,7 . I denne sammenhæng er cytotoksicitet blevet anvendt som en måling til forudsigelse af akut toksicitet for fisk 5,8; Det kan dog have mange andre anvendelser i økotoksicitetsundersøgelser, såsom definition af subcytotoksiske koncentrationer af kemiske stoffer for at studere deres mest forskelligartede sæt virkninger på fisk (f.eks. hormonforstyrrende virkninger).

I cellekultursystemer (in vitro-systemer ) kan cytotoksiciteten af kemiske stoffer bestemmes ved metoder, der er forskellige i typerne af endepunkter. For eksempel kan en cytotoksicitetsmetode baseres på et endepunkt relateret til specifik morfologi observeret under celledødsprocessen, mens en anden kan bestemme cytotoksicitet ved måling af celledød, levedygtighed og funktionalitet, morfologi, energimetabolisme og cellebinding og -proliferation. Kemiske stoffer kan påvirke cellernes levedygtighed gennem forskellige mekanismer, og derfor er det nødvendigt at foretage en cytotoksicitetsvurdering, der dækker forskellige endepunkter for cellelevedygtighed, for at forudsige kemiske virkninger9.

MTT og Alamar Blue (AB) er assays, der bestemmer effekter på cellelevedygtighed baseret på cellemetabolisk aktivitet. MTT-analysen evaluerer aktiviteten af mitokondrieenzymet succinatdehydrogenase10. Reduktionen af gullig 3-[4,5-dimethylthiazol-2yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) til formazanblåt forekommer kun i levedygtige celler, og dens optiske densitet er direkte proportional med antallet af levedygtige celler10. AB-analysen er en følsom oxidationsreduktionsindikator, medieret af mitokondrieenzymer, der fluorescerer og ændrer farve ved reduktion af resazurin til resorufin af levende celler11; cytosoliske og mikrosomale enzymer bidrager imidlertid også til reduktionen af AB og MTT12. Disse enzymer kan omfatte flere reduktaser, såsom alkohol og aldehydoxidoreduktaser, NAD (p) H: quinonoxidoreduktase, flavinreduktase, NADH-dehydrogenase og cytokromer11.

Det neutrale røde (NR) assay er et cellelevedygtighedsassay baseret på inkorporeringen af dette farvestof i lysosomerne i levedygtige celler13. Optagelsen af NR afhænger af cellernes evne til at opretholde pH-gradienter. Protongradienten inde i lysosomerne opretholder en pH, der er lavere end cytoplasmaet. Ved normal fysiologisk pH præsenterer NR en nettoladning på ca. nul, hvilket gør det muligt at trænge ind i cellemembraner. Således bliver farvestoffet ladet og bevares inde i lysosomerne. Jo større mængden af tilbageholdt NR er, desto større er antallet af levedygtige celler14. Kemiske stoffer, der beskadiger celleoverfladen eller lysosomale membraner, forringer optagelsen af dette farvestof.

CFDA-AM-analysen er et fluorometrisk cellelevedygtighedsassay baseret på tilbageholdelse af 5-carboxyfluoresceindiacetatacetoxymethylester (CFDA-AM)15. 5-CFDA-AM, et esterasesubstrat, omdannes til carboxyfluorescein, et fluorescerende stof, der er polært og ikke-permeabelt af membraner i levende celler15; Således bevares den i indersiden af en intakt cellemembran, hvilket indikerer levedygtige celler.

For nylig blev tre cytotoksicitetsassays (CFDA-AM-, NR- og AB-assays) kombineret i en valideret ISO (International Organization for Standardization) retningslinje (ISO 21115: 2019)16 og OECD (Organization for Economic Co-operation and Development) testmetode (OECD TG 249) for at evaluere akut toksicitet for fisk ved hjælp af RTgill-W1-cellelinjen (permanent cellelinje fra regnbueørred [Oncorhynchus mykiss] gill) i 24-brøndplader17 . Selvom der findes en cellebaseret metode til at forudsige akut toksicitet for fisk, er der investeret i at udvikle lignende metoder med andre fiskearter og øge metodens gennemstrømning. Nogle eksempler omfatter udvikling af ZFL-cellelinjer transfekteret med reportergener for specifikke toksicitetsveje18,19, fototoksicitetstest i RTgill-W1-cellelinje 20 og anvendelse af ZFL- og ZF4-cellelinjer (zebrafisk fibroblastisk afledt af 1 dag gamle embryoner) til vurdering af toksicitet ved flere cytotoksicitetsassays21.

Danio rerio (zebrafisk) er en af de vigtigste fiskearter, der anvendes i akvatiske toksicitetsundersøgelser. Således kan cellebaserede metoder med zebrafiskcellelinjer til test af fisketoksicitet være yderst nyttige. ZFL-cellelinjen er en zebrafiskepitelhepatocytcellelinje, der præsenterer de vigtigste egenskaber ved leverparenkymale celler og kan metabolisere xenobiotika 7,22,23,24,25. I mellemtiden er ZEM2S-cellelinjen en embryonal zebrafisk fibroblastisk cellelinje afledt af blastula-stadiet, der kan bruges til at undersøge udviklingseffekter på fisk26,27. Således beskriver denne protokol fire cytotoksicitetsassays (MTT-, AB-, NR- og CFDA-AM-assays) med modifikationer, der skal udføres med ZFL- og ZEM2S-cellelinjer i 96-brøndplader.

Protocol

BEMÆRK: Se materialetabellen for listen over materialer, der anvendes i denne protokol, og tabel 1 for sammensætningen af opløsninger og medier, der anvendes i denne protokol. 1. Forberedelse af ZFL- og ZEM2S-celler Der indledes med en T75-kolbe ZFL- eller ZEM2S-celler med 80 % sammenløb, dyrket i det respektive komplette substrat ved 28 °C uden CO2. Dyrkningsmediet fjernes fra kolben, og cellerne vaskes ved…

Representative Results

Figur 3 viser pladerne i AB-, CFDA-AM-, NR- og MTT-assays. For AB-analysen (figur 3A) viser de tomme brønde og brønde med ingen eller et reduceret antal levedygtige celler blå farve og lav fluorescens, mens brøndene med et stort antal levedygtige celler er lyserøde og præsenterer høje fluorescensværdier på grund af omdannelsen af resazurin (AB) til resorufin (lyserødt stof) af de levedygtige celler. For CFDA-AM-analysen er der ingen synlig forskel i fa…

Discussion

Cytotoksicitetsanalyser anvendes i vid udstrækning til de vitro-toksicitetsevaluering, og denne protokolartikel præsenterer fire almindeligt anvendte cytotoksicitetsassays, der er modificeret til at blive udført i zebrafiskcellelinjer (dvs. celletæthed for 96-brøndplade, inkubationstid i MTT-assayet, FBS-udtømning under den kemiske eksponeringstilstand og maksimal acceptabel koncentration for SC). Da disse analyser kvantificerer cytotoksicitet ved hjælp af forskellige endepunkter for cellelevedygtighed (m…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Til minde om Dr. Márcio Lorencini, medforfatter af dette arbejde, en fremragende forsker inden for kosmetik og dedikeret til at fremme kosmetisk forskning i Brasilien. Forfatterne er taknemmelige for flerbrugerlaboratoriet i fysiologiafdelingen (UFPR) for tilgængelighed af udstyr og for den økonomiske støtte fra koordineringen til forbedring af personale på videregående uddannelser (CAPES, Brasilien) (finanskode 001) og Grupo Boticario.

Materials

5-CFDA, AM (5-Carboxyfluorescein Diacetate, Acetoxymethyl Ester) Invitrogen C1345
Cell culture plate, 96 well plate Sarstedt 83.3924 Surface: Standard, flat base
DMEM Gibco 12800-017 Powder, high glucose, pyruvate
Ham's F-12 Nutrient Mix, powder Gibco 21700026 Powder
HEPES (1 M) Gibco 15630080
Leibovitz's L-15 Medium Gibco 41300021 Powder
Neutral red  Sigma-Aldrich N4638 Powder, BioReagent, suitable for cell culture
Orbital shaker  Warmnest KLD-350-BI 22 mm rotation diameter
Dulbeccos PBS (10X) with calcium and magnesium Invitrogen 14080055
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122
Resazurin sodium salt  Sigma-Aldrich R7017 Powder, BioReagent, suitable for cell culture
RPMI 1640 Medium Gibco 31800-014 Powder
SFB – Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions Gibco 12657-029
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 Powder,  bioreagent for molecular biology
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide  98% Sigma-Aldrich M2128
Trypan blue stain (0.4%) Gibco 15250-061
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red Gibco 15400054
ZEM2S cell line ATCC CRL-2147 This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J.
Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA)
ZFL cell line BCRJ 256
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. ECHA. Non-Animal Approaches-Current Status of Regulatory Applicability Under the REACH, CLP and Biocidal Products Regulations. ECHA. , (2017).
  2. Alternative Methods Accepted by US Agencies. National Toxicology Program, and US Department of Health and Human Services Available from: https://ntp.niehs.nih.gov/whatwestudy/niceatm/accept-methods/index.html (2022)
  3. Schirmer, K. Proposal to improve vertebrate cell cultures to establish them as substitutes for the regulatory testing of chemicals and effluents using fish. Toxicology. 224 (3), 163-183 (2006).
  4. Scholz, S., et al. Alternatives to in vivo tests to detect endocrine disrupting chemicals (EDCs) in fish and amphibians-screening for estrogen, androgen and thyroid hormone disruption. Critical Reviews in Toxicology. 43 (1), 45-72 (2013).
  5. Tanneberger, K., et al. Predicting fish acute toxicity using a fish gill cell line-based toxicity assay. Environmental Science & Technology. 47 (2), 1110-1119 (2013).
  6. Roesler, R., Lorencini, M., Pastore, G. Brazilian cerrado antioxidant sources: cytotoxicity and phototoxicity in vitro. Food Science and Technology. 30, 814-821 (2010).
  7. Ruyra, A., et al. Zebrafish liver (ZFL) cells are able to mount an anti-viral response after stimulation with Poly (I:C). Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 182, 55-63 (2015).
  8. Natsch, A., Laue, H., Haupt, T., von Niederhäusen, V., Sanders, G. Accurate prediction of acute fish toxicity of fragrance chemicals with the RTgill-W1 cell assay. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (3), 931-941 (2018).
  9. Freshney, R. I. Cytotoxicity. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. , (2005).
  10. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  11. O’Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. European Journal of Biochemistry. 267 (17), 5421-5426 (2000).
  12. Gonzalez, R. J., Tarloff, J. B. Evaluation of hepatic subcellular fractions for Alamar blue and MTT reductase activity. Toxicology In Vitro. 15 (3), 257-259 (2001).
  13. Borenfreund, E., Puerner, J. A. Toxicity determined in vitro by morphological alterations and neutral red absorption. Toxicology Letters. 24 (2-3), 119-124 (1985).
  14. Repetto, G., del Peso, A., Zurita, J. L. Neutral red uptake assay for the estimation of cell viability/cytotoxicity. Nature Protocols. 3 (7), 1125-1131 (2008).
  15. Kamiloglu, S., Sari, G., Ozdal, T., Capanoglue, E. Guidelines for cell viability assays. Food Frontiers. 1 (3), 332-349 (2020).
  16. Water Quality-Determination of Acute Toxicity of Water Samples and Chemicals to a Fish Gill Cell Line (RTgill-W1) (ISO 21115:2019). International Organization for Standardization Available from: https://www.iso.org/standar/69933.html (2019)
  17. Organisation for Economic Co-operation and Development. . Test Guideline No. 249: Fish Cell Line Acute Toxicity-The RTgill-W1 Cell Line Assay. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. Effects on Biotic Systems. , (2021).
  18. Lungu-Mitea, S., Lundqvist, J. Potentials and pitfalls of transient in vitro reporter bioassays: interference by vector geometry and cytotoxicity in recombinant zebrafish cell lines. Archives of Toxicology. 94 (8), 2769-2784 (2020).
  19. Lungu-Mitea, S., Han, Y., Lundqvist, J. Development, scrutiny, and modulation of transient reporter gene assays of the xenobiotic metabolism pathway in zebrafish hepatocytes. Cell Biology and Toxicology. , 1-23 (2021).
  20. Schirmer, K., Chan, A. G., Greenberg, B. M., Dixon, D. G., Bols, N. C. Methodology for demonstrating and measuring the photocytotoxicity of fluoranthene to fish cells in culture. Toxicology In Vitro. 11 (1-2), 107-119 (1997).
  21. Lungu-Mitea, S., et al. Modeling bioavailable concentrations in zebrafish cell lines and embryos increases the correlation of toxicity potencies across test systems. Environmental Science & Technology. 55 (1), 447-457 (2021).
  22. Cavalcante, D. G. S. M., et al. Cytotoxic, biochemical and genotoxic effects of biodiesel produced by different routes on ZFL cell line. Toxicology In Vitro. 28 (6), 1117-1125 (2014).
  23. Meng, Q., Yeung, K., Chan, K. M. Toxic effects of octocrylene on zebrafish larvae and liver cell line (ZFL). Aquatic Toxicology. 236, 105843 (2021).
  24. Kwok, M. L., Chan, K. M. Oxidative stress and apoptotic effects of copper and cadmium in the zebrafish liver cell line ZFL. Toxicology Reports. 7, 822-835 (2020).
  25. Yang, J., Chan, K. M. Evaluation of the toxic effects of brominated compounds (BDE-47, 99, 209, TBBPA) and bisphenol A (BPA) using a zebrafish liver cell line, ZFL. Aquatic Toxicology. 159, 138-147 (2015).
  26. Bradford, C. S., Sun, L., Collodi, P., Barnes, D. W. Cell cultures from zebrafish embryos and adult tissues. Journal of Tissue Culture Methods. 16 (2), 99-107 (1994).
  27. He, S., et al. Genetic and transcriptome characterization of model zebrafish cell lines. Zebrafish. 3 (4), 441-453 (2006).
  28. Mansoury, M., Hamed, M., Karmustaji, R., Al Hannan, F., Safrany, S. T. The edge effect: A global problem. The trouble with culturing cells in 96-well plates. Biochemistry and Biophysics Reports. 26, 100987 (2021).
  29. Funk, D., Schrenk, H. -. H., Frei, E. Serum albumin leads to false-positive results in the XTT and the MTT assay. BioTechniques. 43 (2), 178 (2007).
  30. Dayeh, V. R., Bols, N. C., Tanneberger, K., Schirmer, K., Lee, L. E. J. The use of fish-derived cell lines for investigation of environmental contaminants: An update following OECD’s fish toxicity testing framework no. 171. Current Protocols in Toxicology. 1, (2013).
  31. Stepanenko, A. A., Dmitrenko, V. V. Pitfalls of the MTT assay: Direct and off-target effects of inhibitors can result in over/underestimation of cell viability. Gene. 574 (2), 193-203 (2015).
  32. Ulukaya, E., Colakogullari, M., Wood, E. J. Interference by anti-cancer chemotherapeutic agents in the MTT-tumor chemosensitivity assay. Chemotherapy. 50 (1), 43-50 (2004).
  33. Sebaugh, J. L. Guidelines for accurate EC50/IC50 estimation. Pharmaceutical Statistics. 10 (2), 128-134 (2011).
  34. Weimer, M., et al. The impact of data transformations on concentration-response modeling. Toxicology Letters. 213 (2), 292-298 (2012).
  35. Green, J. W., Holbech, T. A., Henrik, Chapter 4: Analysis of Continuous Data (Regression). Statistical Analysis of Ecotoxicity Studies. , (2018).
  36. Proença, S., et al. Effective exposure of chemicals in in vitro cell systems: A review of chemical distribution models. Toxicology In Vitro. 73, 105133 (2021).
  37. Guidony, N. S., et al. ABC proteins activity and cytotoxicity in zebrafish hepatocytes exposed to triclosan. Environmental Pollution. 271, 116368 (2021).
  38. da Silva, N. D. G., et al. Interference of goethite in the effects of glyphosate and Roundup® on ZFL cell line. Toxicology In Vitro. 65, 104755 (2020).
  39. Yang, Y., et al. Temperature is a key factor influencing the invasion and proliferation of Toxoplasma gondii in fish cells. Experimental Parasitology. 217, 107966 (2020).
  40. Lopes, F. M., Sandrini, J. Z., Souza, M. M. Toxicity induced by glyphosate and glyphosate-based herbicides in the zebrafish hepatocyte cell line (ZF-L). Ecotoxicology and Environmental Safety. 162, 201-207 (2018).
  41. Lachner, D., Oliveira, L. F., Martinez, C. B. R. Effects of the water soluble fraction of gasoline on ZFL cell line: Cytotoxicity, genotoxicity and oxidative stress. Toxicology In Vitro. 30, 225-230 (2015).
  42. Morozesk, M., et al. Effects of multiwalled carbon nanotubes co-exposure with cadmium on zebrafish cell line: Metal uptake and accumulation, oxidative stress, genotoxicity and cell cycle. Ecotoxicology and Environmental Safety. 202, 110892 (2020).
  43. Dognani, G., et al. Nanofibrous membranes for low-concentration Cr VI adsorption: kinetic, thermodynamic and the influence on ZFL cells viability. Materials Research. , 24 (2021).
  44. ZEM2S (ATCC®CRL-2147™). American Type Culture Collection Available from: https://www.atcc.org/products/crl-2147 (2023)
  45. Chen, Y., et al. Acute toxicity of the cationic surfactant C12-benzalkonium in different bioassays: how test design affects bioavailability and effect concentrations. Environmental Toxicology and Chemistry. 33 (3), 606-615 (2014).
  46. Pomponio, G., et al. In vitro kinetics of amiodarone and its major metabolite in two human liver cell models after acute and repeated treatments. Toxicology In Vitro. 30, 36-51 (2015).
  47. Mori, M., Wakabayashi, M. Cytotoxicity evaluation of chemicals using cultured fish cells. Water Science and Technology. 42 (7-8), 277-282 (2000).
  48. Caminada, D., Escher, C., Fent, K. Cytotoxicity of pharmaceuticals found in aquatic systems: comparison of PLHC-1 and RTG-2 fish cell lines. Aquatic Toxicology. 79 (2), 114-123 (2006).
  49. Giltrap, M., et al. In vitro screening of organotin compounds and sediment extracts for cytotoxicity to fish cells. Environmental Toxicology and Chemistry. 30 (1), 154-161 (2011).
  50. Hollert, H., Duerr, M., Erdinger, L., Braunbeck, T. Cytotoxicity of settling particulate matter and sediments of the Neckar River (Germany) during a winter flood. Environmental Toxicology and Chemistry. 19 (3), 528-534 (2000).
  51. Pannetier, P., et al. Toxicity assessment of pollutants sorbed on environmental sample microplastics collected on beaches: Part I-adverse effects on fish cell line. Environmental Pollution. 248, 1088-1097 (2019).
  52. Ternjej, I., Srček, V. G., Mihaljević, Z., Kopjar, N. Cytotoxic and genotoxic effects of water and sediment samples from gypsum mining area in channel catfish ovary (CCO) cells. Ecotoxicology and Environmental Safety. 98, 119-127 (2013).
  53. Hamid, R., Rotshteyn, Y., Rabadi, L., Parikh, R., Bullock, P. Comparison of alamar blue and MTT assays for high throughput screening. Toxicology In Vitro. 18 (5), 703-710 (2004).
  54. Vistica, D. T., et al. Tetrazolium-based assays for cellular viability: a critical examination of selected parameters affecting formazan production. Investigación sobre el cáncer. 51 (10), 2515-2520 (1991).
  55. Knauer, K., Lampert, C., Gonzalez-Valero, J. Comparison of in vitro and in vivo acute fish toxicity in relation to toxicant mode of action. Chemosphere. 68 (8), 1435-1441 (2007).
  56. Stadnicka-Michalak, J., Tanneberger, K., Schirmer, K., Ashauer, R. Measured and modeled toxicokinetics in cultured fish cells and application to in vitro-in vivo toxicity extrapolation. PLoS One. 9 (3), 92303 (2014).

Tags

Cytotoxicity AssayZebrafish Cell LinesZEM2SZFL96-well PlateCell ViabilityAcute ToxicityEcotoxicityAlternative Fish AssaysHepatocytesEmbryonic CellsCell SuspensionMulti-channel PipetteTest ChemicalsTriton X-100Exposure Media

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Rodrigues de Souza, I., Wilke Sivek, T., Vaz de Oliveira, J. B., Di Pietro Micali Canavez, A., de Albuquerque Vita, N., Cigaran Schuck, D., Rodrigues de Souza, I., Cestari, M. M., Lorencini, M., Leme, D. M. Cytotoxicity Assays with Zebrafish Cell Lines. J. Vis. Exp. (191), e64860, doi:10.3791/64860 (2023).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image