यह प्रोटोकॉल आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले साइटोटॉक्सिसिटी परख (अलामर ब्लू [एबी], सीएफडीए-एएम, न्यूट्रल रेड और एमटीटी परख) को प्रस्तुत करता है जो 96-वेल प्लेटों में जेब्राफिश भ्रूण (जेडईएम 2 एस) और यकृत (जेडएफएल) सेल लाइनों में साइटोटॉक्सिसिटी के आकलन के लिए अनुकूलित है।
इकोटॉक्सिसिटी अध्ययनों में मछली सेल लाइनों का तेजी से उपयोग किया गया है, और साइटोटॉक्सिसिटी परख को मछली तीव्र विषाक्तता की भविष्यवाणी करने के तरीकों के रूप में प्रस्तावित किया गया है। इस प्रकार, यह प्रोटोकॉल 96-वेल प्लेटों में ज़ेबराफिश (डेनियो रेरियो) भ्रूण (जेडईएम 2 एस) और यकृत (जेडएफएल) सेल लाइनों में सेल व्यवहार्यता का मूल्यांकन करने के लिए संशोधित साइटोटॉक्सिसिटी परख प्रस्तुत करता है। मूल्यांकन किए गए साइटोटॉक्सिसिटी समापन बिंदु माइटोकॉन्ड्रियल अखंडता (अलामार ब्लू [एबी] और एमटीटी परख), एस्टेरेज गतिविधि (सीएफडीए-एएम परख) के माध्यम से झिल्ली अखंडता, और लाइसोसोमल झिल्ली अखंडता (तटस्थ लाल [एनआर] परख) हैं। 96-वेल प्लेट में परीक्षण पदार्थों के संपर्क में आने के बाद, साइटोटॉक्सिसिटी परख का प्रदर्शन किया जाता है; यहां, एबी और सीएफडीए-एएम एक साथ किए जाते हैं, इसके बाद एक ही प्लेट पर एनआर होता है, जबकि एमटीटी परख एक अलग प्लेट पर किया जाता है। इन परखों के लिए रीडआउट एबी और सीएफडीए-एएम के लिए प्रतिदीप्ति द्वारा लिया जाता है, और एमटीटी और एनआर के लिए अवशोषण किया जाता है। इन मछली सेल लाइनों के साथ किए गए साइटोटॉक्सिसिटी परख का उपयोग मछली पर रासायनिक पदार्थों की तीव्र विषाक्तता का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।
रासायनिक पदार्थों को मानव स्वास्थ्य और पर्यावरण के लिए उनकी सुरक्षा के बारे में परीक्षण करने की आवश्यकता है। नियामक एजेंसियों और / या कानूनों (जैसे, रीच, ओईसीडी, यूएस ईपीए) 1,2 द्वारा जीवित जीवों पर प्रभाव की भविष्यवाणी करने के लिए सुरक्षा आकलन में आणविक और सेलुलर बायोमाकर्स पर तेजी से विचार किया गया है, क्योंकि वे विवो प्रतिकूल परिणाम (जैसे, अंतःस्रावी व्यवधान, प्रतिरक्षात्मक प्रतिक्रिया, तीव्र विषाक्तता, फोटोटॉक्सिसिटी) 3,4,5,6,7 से पहले हो सकते हैं। . इस संदर्भ में, साइटोटॉक्सिसिटी को मछली तीव्र विषाक्तता 5,8 की भविष्यवाणी करने के लिए एक माप के रूप में लिया गया है; हालांकि, इकोटॉक्सिसिटी अध्ययनों में इसके कई अन्य अनुप्रयोग हो सकते हैं, जैसे कि मछली पर प्रभावों के अपने सबसे विविध सेट का अध्ययन करने के लिए रासायनिक पदार्थों की उप-साइटोटोक्सिक सांद्रता को परिभाषित करना (जैसे, अंतःस्रावी-विघटनकारी प्रभाव)।
सेल कल्चर सिस्टम (इन विट्रो सिस्टम) में, रासायनिक पदार्थों की साइटोटॉक्सिसिटी को समापन बिंदुओं के प्रकारों में भिन्न तरीकों से निर्धारित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एक साइटोटॉक्सिसिटी विधि कोशिका मृत्यु प्रक्रिया के दौरान देखी गई विशिष्ट आकृति विज्ञान से संबंधित समापन बिंदु पर आधारित हो सकती है, जबकि दूसरा कोशिका मृत्यु, व्यवहार्यता और कार्यक्षमता, आकृति विज्ञान, ऊर्जा चयापचय और कोशिका लगाव और प्रसार के माप द्वारा साइटोटॉक्सिसिटी निर्धारित कर सकता है। रासायनिक पदार्थ विभिन्न तंत्रों के माध्यम से सेल व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकते हैं, इस प्रकाररासायनिक प्रभावों की भविष्यवाणी करने के लिए विभिन्न सेल व्यवहार्यता समापन बिंदुओं को कवर करने वाला साइटोटॉक्सिसिटी मूल्यांकन आवश्यक है।
एमटीटी और अलामार ब्लू (एबी) परख हैं जो सेल चयापचय गतिविधि के आधार पर सेल व्यवहार्यता पर प्रभाव निर्धारित करते हैं। एमटीटी परख माइटोकॉन्ड्रियल एंजाइम सक्सिनेट डिहाइड्रोजनेज10 की गतिविधि का मूल्यांकन करता है। पीले रंग के 3-[4,5-डाइमिथाइलथियाज़ोल-2इल]-2,5-डिफेनिलटेट्राज़ोलियम ब्रोमाइड (एमटीटी) की फॉर्माज़ान ब्लू में कमी केवल व्यवहार्य कोशिकाओं में होती है, और इसका ऑप्टिकल घनत्व व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या10 के सीधे आनुपातिक होता है। एबी परख एक संवेदनशील ऑक्सीकरण-कमी संकेतक है, जो माइटोकॉन्ड्रियल एंजाइमों द्वारा मध्यस्थ है जो जीवित कोशिकाओं द्वारा रेसाज़ुरिन को रेसोरुफिन में कम करने पर रंग बदलताहै। हालांकि, साइटोसोलिक और माइक्रोसोमल एंजाइम भी एबी और एमटीटी12 की कमी में योगदान करते हैं। इन एंजाइमों में कई रिडक्टेस शामिल हो सकते हैं, जैसे कि अल्कोहल और एल्डिहाइड ऑक्सीडोरडक्टेस, एनएडी (पी) एच: क्विनोन ऑक्सीडोरडक्टेस, फ्लेविन रिडक्टेस, एनएडीएच डिहाइड्रोजनेज और साइटोक्रोम11।
न्यूट्रल रेड (एनआर) परख एक सेल व्यवहार्यता परख है जो व्यवहार्य कोशिकाओं के लाइसोसोम में इस डाई को शामिल करने पर आधारितहै। एनआर का उत्थान पीएच ग्रेडिएंट बनाए रखने के लिए कोशिकाओं की क्षमता पर निर्भर करता है। लाइसोसोम के अंदर प्रोटॉन ढाल साइटोप्लाज्म की तुलना में कम पीएच बनाए रखता है। सामान्य शारीरिक पीएच पर, एनआर लगभग शून्य का शुद्ध चार्ज प्रस्तुत करता है, जो इसे कोशिका झिल्ली में प्रवेश करने में सक्षम बनाता है। इस प्रकार, डाई चार्ज हो जाती है और लाइसोसोम के अंदर बनी रहती है। नतीजतन, बनाए गए एनआर की मात्रा जितनी अधिक होगी, व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्याउतनी ही अधिक होगी। रासायनिक पदार्थ जो कोशिका की सतह या लाइसोसोमल झिल्ली को नुकसान पहुंचाते हैं, इस डाई के उत्थान को बाधित करते हैं।
सीएफडीए-एएम परख एक फ्लोरोमेट्रिक सेल व्यवहार्यता परख है जो 5-कार्बोक्सीफ्लोरेसिन डायसेटेट एसिटॉक्सीमिथाइल एस्टर (सीएफडीए-एएम) 15 के प्रतिधारण पर आधारित है। 5-सीएफडीए-एएम, एक एस्टरेज़ सब्सट्रेट, कार्बोक्सीफ्लोरेसिन में परिवर्तित हो जाता है, एक फ्लोरोसेंट पदार्थ जो जीवित कोशिकाओं के झिल्ली द्वारा ध्रुवीय और गैर-पारगम्य है15; इस प्रकार, यह एक बरकरार कोशिका झिल्ली के आंतरिक पक्ष में बरकरार रखा जाता है, जो व्यवहार्य कोशिकाओं का संकेत देता है।
हाल ही में, तीन साइटोटॉक्सिसिटी परख (सीएफडीए-एएम, एनआर, और एबी परख) को एक मान्य आईएसओ (मानकीकरण के लिए अंतर्राष्ट्रीय संगठन) दिशानिर्देश (आईएसओ 21115: 2019)16 और ओईसीडी (आर्थिक सहयोग और विकास संगठन) परीक्षण विधि (ओईसीडी टीजी 249) में संयुक्त किया गया था ताकि 24-वेल प्लेटों में आरटीगिल-डब्ल्यू 1 सेल लाइन (रेनबो ट्राउट [ऑन्कोरिन्चस मायकिस] गिल से स्थायी सेल लाइन) का उपयोग करके मछली तीव्र विषाक्तता का मूल्यांकनकिया जा सके। . यद्यपि मछली तीव्र विषाक्तता की भविष्यवाणी करने के लिए एक मौजूदा सेल-आधारित विधि है, अन्य मछली प्रजातियों के साथ समान तरीकों को विकसित करने और विधि के थ्रूपुट को बढ़ाने में प्रयास किए गए हैं। कुछ उदाहरणों में विशिष्ट विषाक्ततामार्गों 18,19 के लिए रिपोर्टर जीन के साथ स्थानांतरित जेडएफएल सेललाइनों का विकास, आरटीगिल-डब्ल्यू 1 सेल लाइन20 में फोटोटॉक्सिसिटी परीक्षण, और जेडएफएल और जेडएफ 4 सेल लाइनों (1 दिन पुराने भ्रूण से प्राप्त ज़ेब्राफिश फाइब्रोब्लास्टिक) का उपयोग शामिल है।
डेनियो रेरियो (ज़ेबराफिश) जलीय विषाक्तता अध्ययन में उपयोग की जाने वाली मुख्य मछली प्रजातियों में से एक है; इस प्रकार, मछली विषाक्तता परीक्षण के लिए ज़ेब्राफिश सेल लाइनों के साथ सेल-आधारित तरीके बेहद उपयोगी हो सकते हैं। जेडएफएल सेल लाइन एक ज़ेब्राफिश उपकला हेपेटोसाइट सेल लाइन है जो यकृत पैरेन्काइमल कोशिकाओं की मुख्य विशेषताओं को प्रस्तुत करती है और ज़ेनोबायोटिक्स 7,22,23,24,25 को चयापचय कर सकती है। इस बीच, जेडईएम 2 एस सेल लाइन ब्लास्टुला चरण से प्राप्त एक भ्रूण जेब्राफिश फाइब्रोब्लास्टिक सेल लाइन है जिसका उपयोग मछली26,27 पर विकासात्मक प्रभावों की जांच के लिए किया जा सकता है। इस प्रकार, यह प्रोटोकॉल चार साइटोटॉक्सिसिटी परख (एमटीटी, एबी, एनआर, और सीएफडीए-एएम परख) का वर्णन करता है, जिसमें 96-वेल प्लेटों में जेडएफएल और जेडईएम 2 एस सेल लाइनों के साथ किए जाने वाले संशोधन शामिल हैं।
साइटोटॉक्सिसिटी परख का व्यापक रूप से इन विट्रो विषाक्तता मूल्यांकन के लिए उपयोग किया जाता है, और यह प्रोटोकॉल लेख जेब्राफिश सेल लाइनों (यानी, 96-वेल प्लेट के लिए सेल घनत्व, एमटीटी परख में इनक्यूबेशन ?…
The authors have nothing to disclose.
मार्सियो लोरेनसिनी की याद में, इस काम के सह-लेखक, सौंदर्य प्रसाधन के क्षेत्र में एक उत्कृष्ट शोधकर्ता और ब्राजील में कॉस्मेटिक अनुसंधान को बढ़ावा देने के लिए समर्पित। लेखक उपकरणों की उपलब्धता के लिए फिजियोलॉजी विभाग (यूएफपीआर) में बहु-उपयोगकर्ता प्रयोगशाला के लिए और उच्च शिक्षा कर्मियों के सुधार के लिए समन्वय (सीएपीएस, ब्राजील) (वित्त कोड 001) और ग्रुपो बोटिकारियो के वित्तीय समर्थन के लिए आभारी हैं।
5-CFDA, AM (5-Carboxyfluorescein Diacetate, Acetoxymethyl Ester) | Invitrogen | C1345 | |
Cell culture plate, 96 well plate | Sarstedt | 83.3924 | Surface: Standard, flat base |
DMEM | Gibco | 12800-017 | Powder, high glucose, pyruvate |
Ham's F-12 Nutrient Mix, powder | Gibco | 21700026 | Powder |
HEPES (1 M) | Gibco | 15630080 | |
Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 41300021 | Powder |
Neutral red | Sigma-Aldrich | N4638 | Powder, BioReagent, suitable for cell culture |
Orbital shaker | Warmnest | KLD-350-BI | 22 mm rotation diameter |
Dulbeccos PBS (10X) with calcium and magnesium | Invitrogen | 14080055 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
Resazurin sodium salt | Sigma-Aldrich | R7017 | Powder, BioReagent, suitable for cell culture |
RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-014 | Powder |
SFB – Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | Gibco | 12657-029 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Powder, bioreagent for molecular biology |
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide 98% | Sigma-Aldrich | M2128 | |
Trypan blue stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 | |
ZEM2S cell line | ATCC | CRL-2147 | This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J. Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA) |
ZFL cell line | BCRJ | 256 |