Summary

نمذجة تطور المخيخ البشري في المختبر في هيكل 2D

Published: September 16, 2022
doi:

Summary

يشرح البروتوكول الحالي توليد طبقة أحادية 2D من الخلايا المخيخية من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات للتحقيق في المراحل المبكرة من تطور المخيخ.

Abstract

يعد التطور الدقيق وفي الوقت المناسب للمخيخ أمرا بالغ الأهمية ليس فقط للتنسيق والتوازن الحركي الدقيق ولكن أيضا للإدراك. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الاضطراب في نمو المخيخ متورط في العديد من اضطرابات النمو العصبي ، بما في ذلك التوحد واضطراب نقص الانتباه وفرط النشاط (ADHD) والفصام. لم تكن التحقيقات في تطور المخيخ لدى البشر ممكنة في السابق إلا من خلال دراسات ما بعد الوفاة أو التصوير العصبي ، ومع ذلك فإن هذه الطرق ليست كافية لفهم التغيرات الجزيئية والخلوية التي تحدث في الجسم الحي أثناء التطور المبكر ، وهو الوقت الذي تنشأ فيه العديد من اضطرابات النمو العصبي. إن ظهور تقنيات لتوليد الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (iPSCs) من الخلايا الجسدية والقدرة على إعادة تمايز الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات إلى خلايا عصبية قد مهدت الطريق للنمذجة في المختبر لنمو الدماغ المبكر. تقدم الدراسة الحالية خطوات مبسطة نحو توليد خلايا مخيخية للتطبيقات التي تتطلب بنية أحادية الطبقة ثنائية الأبعاد (2D). يتم اشتقاق الخلايا المخيخية التي تمثل مراحل النمو المبكرة من iPSCs البشرية من خلال الخطوات التالية: أولا ، تصنع الأجسام الجنينية في ثقافة ثلاثية الأبعاد (3D) ، ثم يتم معالجتها باستخدام FGF2 والأنسولين لتعزيز مواصفات مصير المخيخ ، وأخيرا ، يتم تمييزها بشكل نهائي كطبقة أحادية على ركائز بولي إل أورنيثين (PLO) / لامينين المغلفة. في 35 يوما من التمايز ، تعبر مزارع الخلايا المخيخية المشتقة من iPSC عن علامات المخيخ بما في ذلك ATOH1 و PTF1α و PAX6 و KIRREL2 ، مما يشير إلى أن هذا البروتوكول يولد سلائف الخلايا العصبية المخيخية glutamatergic و GABAergic ، بالإضافة إلى أسلاف خلايا Purkinje. علاوة على ذلك ، تظهر الخلايا المتمايزة مورفولوجيا عصبية مميزة وهي إيجابية لعلامات التألق المناعي للهوية العصبية مثل TUBB3. تعبر هذه الخلايا عن جزيئات التوجيه المحوري ، بما في ذلك semaphorin-4C و plexin-B2 و neuropilin-1 ، ويمكن أن تكون بمثابة نموذج للتحقيق في الآليات الجزيئية لنمو الخلايا العصبية والاتصال المشبكي. تولد هذه الطريقة خلايا عصبية مخيخية بشرية مفيدة للتطبيقات النهائية ، بما في ذلك التعبير الجيني والدراسات الفسيولوجية والمورفولوجية التي تتطلب تنسيقات أحادية الطبقة 2D.

Introduction

إن فهم تطور المخيخ البشري والنوافذ الزمنية الحرجة لهذه العملية أمر مهم ليس فقط لفك تشفير الأسباب المحتملة لاضطرابات النمو العصبي ولكن أيضا لتحديد أهداف جديدة للتدخل العلاجي. كانت نمذجة تطور المخيخ البشري في المختبر صعبة ، ولكن بمرور الوقت ، ظهرت العديد من البروتوكولات التي تميز الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) أو iPSCs مع مصائر النسب المخيخي1،2،3،4،5،6،7،8 . علاوة على ذلك ، من المهم تطوير بروتوكولات تولد نتائج قابلة للتكرار ، وبسيطة نسبيا (لتقليل الخطأ) ، وليست ثقيلة على التكاليف النقدية.

تم إنشاء البروتوكولات الأولى للتمايز المخيخي من ثقافات 2D من الأجسام الجنينية المطلية (EBs) ، مما أدى إلى مصير المخيخ مع عوامل نمو مختلفة مماثلة لتطور الجسم الحي ، بما في ذلك WNT و BMPs و FGFs 1,9. أحدث البروتوكولات المنشورة المستحثة التمايز في المقام الأول في ثقافة العضوية ثلاثية الأبعاد مع FGF2 والأنسولين ، تليها FGF19 و SDF1 للهياكل الشبيهة بالشفاهالمعينية 3،4 ، أو استخدمت مزيجا من FGF2 و FGF4 و FGF85. أدت كلتا طريقتي تحريض المخيخ العضوي إلى عضويات مخيخية 3D مماثلة حيث أبلغ كلا البروتوكولين عن تعبير علامة مخيخ مماثل في نقاط زمنية متطابقة. قام هولمز وهاين بتوسيع بروتوكول 3D5 الخاص بهما لإظهار أنه يمكن توليد خلايا المخيخ ثنائية الأبعاد من hESCs و iPSCs ، والتي تبدأ كمجاميع ثلاثية الأبعاد. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر Silva et al.7 أن الخلايا التي تمثل الخلايا العصبية المخيخية الناضجة في 2D يمكن توليدها بنهج مشابه لهولمز وهاين ، باستخدام نقطة زمنية مختلفة للتبديل من 3D إلى 2D وتمديد وقت النمو والنضج.

يحث البروتوكول الحالي على مصير المخيخ في iPSCs الخالية من التغذية عن طريق توليد أجسام جنينية حرة عائمة (EBs) باستخدام الأنسولين و FGF2 ثم طلاء EBs على أطباق مغلفة ب PLO / laminin في اليوم 14 للنمو والتمايز ثنائي الأبعاد. بحلول اليوم 35 ، يتم الحصول على خلايا ذات هوية مخيخية. القدرة على تلخيص المراحل المبكرة من تطور المخيخ ، وخاصة في بيئة 2D ، تسمح للباحثين بالإجابة على أسئلة محددة تتطلب تجارب مع بنية أحادية الطبقة. هذا البروتوكول قابل أيضا لمزيد من التعديلات مثل الأسطح الدقيقة ، ومقايسات النمو المحوري ، وفرز الخلايا لإثراء مجموعات الخلايا المطلوبة.

Protocol

تمت الموافقة على أبحاث الموضوعات البشرية بموجب موافقة مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة أيوا رقم 201805995 ورقم موافقة لجنة الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات بجامعة أيوا 2017-02. تم الحصول على خزعات الجلد من الأشخاص بعد الحصول على موافقة خطية مستنيرة. تمت زراعة الخلايا الليفية في DMEM مع 15٪ مصل ب…

Representative Results

نظرة عامة على تمايز المخيخ 3D إلى 2Dيتم إنشاء الخلايا المخيخية بدءا من iPSCs. يوضح الشكل 1 أ سير العمل العام وإضافة المكونات الرئيسية للتمايز. في اليوم 0 ، يتم تصنيع EBs عن طريق رفع مستعمرات iPSC برفق (الشكل 1B) باستخدام ماصة زجاجية مسحوبة في CDM تحتوي على SB4315…

Discussion

تعد القدرة على نمذجة نمو المخيخ البشري في المختبر مهمة لنمذجة الأمراض بالإضافة إلى تعزيز فهم نمو الدماغ الطبيعي. تخلق البروتوكولات الأقل تعقيدا وفعالية من حيث التكلفة المزيد من الفرص لتوليد البيانات القابلة للتكرار والتنفيذ الواسع عبر مختبرات علمية متعددة. يتم وصف بروتوكول تمايز ا?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر جيني غرينغر ريتشاردز على عملها الشامل في التحقق من صحة موضوعات التحكم لدينا ، والتي أنشأنا منها iPSCs للتحكم. تم دعم هذا العمل من قبل NIH T32 MH019113 (إلى D.A.M. و K.A.K.) ، و Nellie Ball Trust (إلى T.H.W. و A.J.W.) ، NIH R01 MH111578 (إلى V.A.M. و J.A.W.) ، NIH KL2 TR002536 (إلى A.J.W.) ، وصندوق Roy J. Carver الخيري (إلى V.A.M. ، J.A.W. ، و A.J.W.). تم إنشاء الأرقام مع BioRender.com.

Materials

10 mL Serological pipette Fisher Scientific 13-678-26D
1-thio-glycerol Sigma M6145
2 mL Serological pipette Fisher Scientific 13-678-26B
250 mL Filter Unit, 0.2 µm aPES, 50 mm Dia Fisher Scientific FB12566502
35 mm Easy Grip Tissue Cluture Dish Falcon 353001
4D Nucleofector core unit Lonza 276885 Nucleofector
5 mL Serological pipette Fisher Scientific 13-678-25D
60 mm Easy Grip Tissue Culture Dish Falcon 353004
6-well ultra-low attachment plates Corning 3471
9" Disposable Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-20D
Apo-transferrin Sigma T1147
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A9418
Cell culture grade water Cytiva SH30529.02
Chemically defined lipid concentrate Gibco 11905031
Chroman 1 Cayman 34681
Class II, Type A2, Biological safety Cabinet NuAire, Inc. NU-540-600 Hood, UV light
Costar 24-well plate, TC treated Corning 3526
Costar 6-well plate, TC treated Corning 3516
DAPI solution Thermo Scientific 62248
DMEM Gibco 11965092
DMEM/F12 Gibco 11320033
DMSO (Dimethly sulfoxide) Sigma D2438
DPBS+/+ Gibco 14040133
Emricasan Cayman 22204
Epi5 episomal iPSC reprogramming kit Life Technologies A15960
Essential 8-Flex Gibco A2858501 PSC medium with heat-stable FGF2
EVOS XL Core Imaging system Life Technologies AMEX1000
Fetal bovine serum – Premium Select Atlanta Biologicals S11150
FGF2 Peprotech 100-18B
GlutaMAX supplement Gibco 35050061 L-alanine-L-glutamine supplement
Ham's F12 Nutrient Mix Gibco 11765054
HERAcell VIOS 160i CO2 incubator Thermo Scientific 50144906
Human Anti-EN2, mouse Santa Cruz Biotechnology sc-293311
Human anti-Ki67/MKI67, rabbit R&D Systems MAB7617
Human anti-PTF1a, rabbit Novus Biologicals NBP2-98726
Human anti-TUBB3, mouse Biolegend 801213
IMDM Gibco 12440053
Insulin Gibco 12585
Laminin Mouse Protein Gibco 23017015
Matrigel Matrix Corning 354234 Basement membrane matrix
MEM-NEAA Gibco 11140050
Mini Centrifuge Labnet International C1310 Benchtop mini centrifuge
Monarch RNA Cleanup Kit (50 µg) New England BioLabs T2040 Silica spin columns
Monarch Total RNA Miniprep Kit New England BioLabs T2010 Silica spin columns
N-2 supplement Gibco 17502-048
Neurobasal medium Gibco 21103049
PBS, pH 7.4 Gibco 10010023
PFA 16% Electron Microscopy Sciences 15710
Polyamine supplement Sigma P8483
Poly-L-Ornithine (PLO) Sigma 3655
Potassium chloride Sigma 746436
SB431542 Sigma 54317
See through self-sealable pouches Steriking SS-T2 (90×250) Autoclave pouches
Sodium citrate dihydrate  Fisher Scientific S279-500
Syringe filters, sterile, PES 0.22 µm, 30 mm Dia Research Products International 256131
Trans-ISRIB Cayman 16258
TRIzol Reagent Invitrogen 15596018 Phenol and guanidine isothiocyanate
TrypLE Express Enzyme (1x) Gibco 12604039 Cell dissociation reagent 
Vapor pressure osmometer Wescor, Inc. Model 5520 Osmometer
Y-27632 Biogems 1293823

Referencias

  1. Erceg, S., Lukovic, D., Moreno-Manzano, V., Stojkovic, M., Bhattacharya, S. S. Derivation of cerebellar neurons from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2012).
  2. Erceg, S., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells into functional cerebellar-like cells. Stem Cells and Development. 19 (11), 1745-1756 (2010).
  3. Muguruma, K. 3D culture for self-formation of the cerebellum from human pluripotent stem cells through induction of the isthmic organizer. Methods in Molecular Biology. 1597, 31-41 (2017).
  4. Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
  5. Holmes, D. B., Heine, V. M. Streamlined 3D cerebellar differentiation protocol with optional 2D modification. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56888 (2017).
  6. Holmes, D. B., Heine, V. M. Simplified 3D protocol capable of generating early cortical neuroepithelium. Biology Open. 6 (3), 402-406 (2017).
  7. Silva, T. P., et al. Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 70 (2020).
  8. Nayler, S., Agarwal, D., Curion, F., Bowden, R., Becker, E. B. E. High-resolution transcriptional landscape of xeno-free human induced pluripotent stem cell-derived cerebellar organoids. Scientific Reports. 11, 12959 (2021).
  9. Salero, E., Hatten, M. E. Differentiation of ES cells into cerebellar neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (8), 2997-3002 (2007).
  10. Nie, Y., Walsh, P., Clarke, D. L., Rowley, J. A., Fellner, T. Scalable passaging of adherent human pluripotent stem cells. PLoS One. 9 (1), 88012 (2014).
  11. Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nature Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
  12. Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48 (1), 17-24 (2005).
  13. Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48 (1), 31-43 (2005).
  14. Hoshino, M., et al. Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum. Neuron. 47 (2), 201-213 (2005).
  15. Mizuhara, E., et al. Purkinje cells originate from cerebellar ventricular zone progenitors positive for Neph3 and E-cadherin. Biología del desarrollo. 338 (2), 202-214 (2010).
  16. Ferreira, A., Caceres, A. Expression of the Class III β-tubulin isotype in developing neurons in culture. Journal of Neuroscience Research. 32 (4), 516-529 (1992).
  17. Sullivan, K. F., Cleveland, D. W. Identification of conserved isotype-defining variable region sequences for four vertebrate beta tubulin polypeptide classes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (12), 4327-4331 (1986).
  18. Joyner, A. L. Engrailed, Wnt and Pax genes regulate midbrain-hindbrain development. Trends in Genetics. 12 (1), 15-20 (1996).
  19. Joyner, A. L., Liu, A., Millet, S. Otx2, Gbx2 and Fgf8 interact to position and maintain a mid-hindbrain organizer. Current Opinion in Cell Biology. 12 (6), 736-741 (2000).
  20. Minaki, Y., Nakatani, T., Mizuhara, E., Inoue, T., Ono, Y. Identification of a novel transcriptional corepressor, Corl2, as a cerebellar Purkinje cell-selective marker. Gene Expression Patterns. 8 (6), 418-423 (2008).
  21. Aldinger, K. A., et al. Spatial and cell type transcriptional landscape of human cerebellar development. Nature Neuroscience. 24 (8), 1163-1175 (2021).
  22. Fossat, N., Courtois, V., Chatelain, G., Brun, G., Lamonerie, T. Alternative usage of Otx2 promoters during mouse development. Developmental Dynamics. 233 (1), 154-160 (2005).
  23. Akbarian, S., et al. The PsychENCODE project. Nature Neuroscience. 18 (12), 1707-1712 (2015).
  24. Aijaz, S., et al. Expression analysis of SIX3 and SIX6 in human tissues reveals differences in expression and a novel correlation between the expression of SIX3 and the genes encoding isocitrate dehyhrogenase and cadherin 18. Genomics. 86 (1), 86-99 (2005).
  25. Conte, I., Morcillo, J., Bovolenta, P. Comparative analysis of Six3 and Six6 distribution in the developing and adult mouse brain. Developmental Dynamics. 234 (3), 718-725 (2005).
  26. Andreasen, N. C., Pierson, R. The role of the cerebellum in schizophrenia. Biological Psychiatry. 64 (2), 81-88 (2008).
  27. Nopoulos, P. C., Ceilley, J. W., Gailis, E. A., Andreasen, N. C. An MRI study of cerebellar vermis morphology in patients with schizophrenia: Evidence in support of the cognitive dysmetria concept. Biological Psychiatry. 46 (5), 703-711 (1999).
  28. Jacobsen, L. K., et al. Quantitative morphology of the cerebellum and fourth ventricle in childhood-onset schizophrenia. American Journal of Psychiatry. 154 (12), 1663-1669 (1997).
  29. Saywell, V., Cioni, J. -. M., Ango, F. Developmental gene expression profile of axon guidance cues in Purkinje cells during cerebellar circuit formation. The Cerebellum. 13 (3), 307-317 (2014).
  30. Kim, D., Ackerman, S. L. The UNC5C netrin receptor regulates dorsal guidance of mouse hindbrain axons. Journal of Neuroscience. 31 (6), 2167-2179 (2011).
  31. Maier, V., et al. Semaphorin 4C and 4G are ligands of Plexin-B2 required in cerebellar development. Molecular and Cellular Neuroscience. 46 (2), 419-431 (2011).
  32. Telley, L., et al. Dual function of NRP1 in axon guidance and subcellular target recognition in cerebellum. Neuron. 91 (6), 1276-1291 (2016).
  33. Wang, S., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons. Scientific Reports. 5, 9232 (2015).
  34. Shabanipour, S., et al. Primary culture of neurons isolated from embryonic mouse cerebellum. Journal of Visualized Experiments. (152), e60168 (2019).

Play Video

Citar este artículo
Madencioglu, D. A., Kruth, K. A., Wassink, T. H., Magnotta, V. A., Wemmie, J. A., Williams, A. J. Modeling Human Cerebellar Development In Vitro in 2D Structure. J. Vis. Exp. (187), e64462, doi:10.3791/64462 (2022).

View Video