이 프로토콜은 3D 엔지니어링된 심장 및 골격근 조직을 생성하는 방법을 제공하고 전임상 약물 스크리닝 양식에서의 사용을 설명합니다. 설명된 방법은 자기 감지 시스템을 사용하여 24개의 조직을 동시에 동시에 평가할 수 있습니다.
체외에서 건강 및 질병 상태를 정확하게 모델링하는 것은 새로운 치료 전략 및 치료법 개발에 매우 중요합니다. 심장 및 골격근 질환의 경우 수축력과 동역학이 근육 기능을 평가하기 위한 핵심 지표를 구성합니다. 유도 만능 줄기 세포로부터 조작된 근육 조직(EMT)을 생성하는 새롭고 개선된 방법은 수축 조직에 대한 시험관 내 질병 모델링을 보다 신뢰할 수 있게 만들었습니다. 그러나 부유 세포 배양에서 조직을 재현 가능하게 제작하고 수축성을 측정하는 것은 어려운 일입니다. 이러한 기술은 종종 높은 고장률로 어려움을 겪고 복잡한 계측 및 맞춤형 데이터 분석 루틴이 필요합니다. 3D EMT를 무표지, 고도의 병렬 및 자동화 친화적인 수축성 분석과 함께 활용하는 새로운 플랫폼 및 장치는 이러한 많은 장애물을 우회합니다. 이 플랫폼을 사용하면 거의 모든 셀 소스를 사용하여 3D EMT를 쉽고 재현 가능하게 제작할 수 있습니다. 그런 다음 복잡한 소프트웨어 분석 루틴 없이 24개의 조직을 동시에 측정하는 기기를 통해 조직 수축성을 측정합니다. 이 기기는 마이크로뉴턴의 힘 변화를 안정적으로 측정할 수 있으므로 용량 의존적 화합물 스크리닝을 통해 약물 또는 치료제가 수축 출력에 미치는 영향을 측정할 수 있습니다. 이 장치로 만든 조작된 조직은 완전히 기능하여 전기 자극 시 경련 및 파상풍 수축을 생성하며 몇 주 또는 몇 달에 걸쳐 배양에서 종단으로 분석할 수 있습니다. 여기에서는 예상치 못한 심장 독성으로 인해 환자 사망 후 임상 시험에서 가져온 약물(BMS-986094)을 포함하여 알려진 독성 물질을 급성 및 만성 투여 중인 심장 근육 EMT의 데이터를 보여줍니다. 미오신 억제제 치료에 대한 반응으로 조작된 조직에서 변경된 골격근 기능도 제시됩니다. 이 플랫폼을 통해 연구원은 최소한의 추가 교육이나 기술로 복잡하고 정보가 풍부한 생체 공학 모델 시스템을 약물 발견 워크플로에 통합할 수 있습니다.
유도만능줄기세포(iPSC) 모델은 기초 생물학적 연구 및 질병 모델링 1,2,3,4,5뿐만 아니라 치료제 발견 및 개발을 위한 전임상 파이프라인에서 점점 더 핵심적인 역할을 하고 있습니다. iPSC에서 파생된 심장 및 골격근과 같은 수축 조직은 근육 수축력 및 동역학의 직접적인 평가가 전체 조직 기능을 연구하기 위한 정량적 지표이기 때문에 인간 시험관 내 연구의 예측력을 향상시킬 수 있는 큰 잠재력을 가지고 있습니다 4,6,7,8. 전형적으로, 수축력의 측정은 기판 편향(9,10)의 광학적 추적에 의해 간접적으로 또는 힘 변환기(4,11,12)에 세포/조직을 부착함으로써 직접적으로 얻어졌다. 이러한 방법은 정확하지만 본질적으로 처리량이 낮으며 일반적으로 데이터를 수집하고 분석하려면 고도로 숙련된 작업자가 필요합니다.
이전 연구에서는 자기장 감지가 이러한 장애물을 우회하고 여러 조직 구조에 걸쳐 공학적 근육 기능을 동시에 평가하는 대체 방법을 제공한다는 것을 보여주었습니다13. Mantarray(Magnetometric Analyzer for eNgineered Tissue ARRAY) 3D 수축성 플랫폼은 이 기술을 기반으로 하며, 고처리량 스크리닝을 통해 3D 세포 모델의 복잡성을 활용하는 고도로 평행한 방식으로 조작된 근육 조직의 수축성을 측정할 수 있는 장치를 사용합니다14. 이 플랫폼은 표준 세포 배양 인큐베이터 내부 또는 외부의 심장 및 골격근 조직의 수축 기능에 대한 라벨 없는 정량적 실시간 모니터링을 가능하게 하여 광학 기반 수축성 이미징 및 분석의 필요성을 제거합니다. 이 기술은 건강한 세포주와 질병에 걸린 세포주의 직접적인 비교를 용이하게 하고 수축 조직에 대한 약물의 효과를 측정하여 신규 및 기존 치료 화합물에 대한 정량화 가능한 시험관 내, 안전성 및 효능 데이터를 확립합니다.
엔지니어링된 3D 근육 조직은 Mantarray 소모품인 24웰 주조 플레이트를 사용하여 재현성이 높은 방식으로 두 기둥 사이에서 제작할 수 있습니다(그림 1). 한 기둥은 단단하고 다른 기둥은 유연하고 작은 자석이 있습니다. 조직 구조가 수축하면 유연한 기둥과 내장된 자석을 대체합니다. EMT 플레이트는 기기 내에 배치되며 플레이트 홀더 아래의 회로 기판에 있는 일련의 자기 센서를 통해 사후 변위를 측정합니다. 측정된 자기장의 변화는 수학적 알고리즘을 사용하여 절대 수축력으로 변환됩니다. 이 기기는 빠른 데이터 샘플링 속도를 사용하여 수축 빈도, 속도 및 감쇠 시간을 포함하여 분석 중인 세포 유형의 기능적 용량 및 성숙도에 대한 자세한 정보를 수집할 수 있습니다. 이러한 기능 측정은 자기 감지 플랫폼을 사용하여 24개 웰 모두에서 동시에 또는 기존의 광학 방법을 사용하여 개별적으로 순차적으로 얻을 수 있습니다.
이 연구는 피브린 기반 하이드로겔에서 3D 골격근 및 심장 미세조직을 엔지니어링하기 위한 재현성이 높은 방법을 설명합니다. 80분간의 짧은 반응 동안, 트롬빈은 피브리노겐이 피브린으로 전환되는 것을 촉매하여, 근육 세포가 부유 배양액에서 발달할 수 있는 스캐폴드를 제공한다15. 기질 세포는 매트릭스를 리모델링하는 데 도움이 되며 근육 세포가 하이드로겔 내에서 융합체를 형성함에 따라 조직이 수축하게 됩니다. 이러한 조직의 수축성은 화합물 노출 전후에 자기 감지 접근 방식을 사용하여 분석되었으며, 용량-반응 약물 연구에 사용하기 위해 이 양식을 검증했습니다. 건강한 기증자 생검에서 얻은 1차 인간 근모세포는 상업적으로 입수하여 공급업체의 프로토콜에 따라 2D로 배양했습니다. 세포는 3D 조직을 제작하기에 충분한 세포 수를 생성하기 위해 3개의 계대를 통해 골격근 성장 배지를 사용하여 확장되었습니다. 기질 세포 및 hiPSC 유래 심근 세포를 3일 동안 공급업체의 프로토콜에 따라 배양하여 세포를 조직으로 캐스팅하기 전에 냉동 보존에서 회복할 수 있도록 했습니다. 자기 감지 플랫폼을 사용하여 수집할 수 있는 데이터 세트의 유형을 보여주는 대표적인 결과가 제공됩니다. 이러한 방법을 사용하여 조작된 조직의 생성과 관련된 일반적인 함정도 해결됩니다.
이 연구는 24웰 소모품 주조 키트 내에서 3D 엔지니어링 심장 및 골격근 조직을 생성하는 방법을 설명합니다. 이러한 방법을 따르면 후속 약물 스크리닝을 위한 캐스팅 실패 없이 24개 조직의 완전한 배열을 일관되게 달성할 수 있습니다. 이러한 결과를 달성하기 위한 중요한 고려 사항은 캐스팅 중에 하이드로겔의 조기 중합을 방지하기 위해 모든 단계를 얼음 위에서 수행하고, 조직 캐스팅 전에 세포 해리 시약을 제거하고, 각 조직에 대한 세포와 하이드로겔 현탁액의 철저한 혼합, 조직 간 피펫 팁 교체, 열 비활성화 FBS(전혀 사용하지 않는 경우)의 사용을 보장합니다. 또한 주조가 시작되면 포스트 격자가 움직이지 않고 하이드로겔이 형성되면 부드럽게 이동되도록 하는 것이 중요합니다.
주요 변형에는 심장 대 골격 EMT를 달성하기 위한 다양한 세포 유형의 사용과 세포 성숙 및 조직 안정성을 촉진하기 위해 다양한 농도의 기저막 단백질로 하이드로겔을 도핑하는 것이 포함됩니다. 이러한 도핑의 유익한 효과는 사례별로 테스트되어야 하지만 특정 상황에서 기능적 결과와 조직 수명을 향상시키는 것으로 나타났습니다14,16,22. 또한 나열된 세포 밀도는 지침이며 다른 세포주에 맞게 최적화해야 할 수도 있습니다. 대안적인 하이드로겔 조성물은 또한 달성된 EMTs23,24,25의 구조적 및 기능적 특성을 변형시키는 수단으로서 고려될 수 있다. 천연 근육 미세 환경에는 또한 형태와 기능에서 근세포를 지원하기 위해 혈관 형성, 신경 분포 및 매트릭스 침착을 촉진하는 지지 세포 유형이 포함되어 있습니다26,27. 여기에 설명된 시스템은 현재 섬유아세포를 3D 심장 조직에 통합하지만, 추가 세포 유형은 시험관 내에서 치료 화합물의 안전성과 효능을 연구하기 위해 보다 생리학적으로 관련된 모델을 생성할 수 있습니다. 이전에는 다양한 지지 세포 유형이 3D 엔지니어링 조직에 성공적으로 통합되어 자기 감지 수축성 플랫폼 28,29,30을 사용하여 향후 연구를 위한 흥미로운 템플릿을 제시했습니다.
이 프로토콜의 문제 해결은 주조 공정 중 신뢰할 수 없거나 일관되지 않은 조직의 형성에 중점을 둡니다. 하이드로겔은 혼합하는 동안 세포의 균일한 분포를 촉진하면서 캐스팅될 때 기포가 형성되지 않도록 주의해야 합니다. 이상적인 세포 밀도, 세포 비율 및 매트릭스 구성을 식별하기 위해 각각의 새로운 세포 유형에 대해 최적화 실험이 필요할 수 있습니다.
이 기술의 주요 한계는 24개의 EMT로 구성된 전체 플레이트를 설정하는 데 필요한 상당한 수의 셀입니다. 여기에 제시된 데이터의 경우 플레이트당 1,500만 개의 심근 세포와 1,800만 개의 골격 근모세포가 사용되었습니다. 특정 연구자들은 이러한 대규모 세포 물질 풀에 접근하지 못할 수 있으며, 이로 인해 이 플랫폼을 최대한 활용하는 능력이 저해될 수 있습니다. 최종 사용자가 자기 감지 하드웨어에 액세스할 수 없는 경우 사후 처짐 측정을 광학적으로 수행해야 하므로 처리량이 크게 감소하고 여러 웰에서 근육 수축이 동시에 기록되지 않습니다. 그러나 Mantarray 하드웨어는 이러한 한계를 극복하여 여러 구조에서 동시에 EMT 수축을 지속적이고 비침습적으로 분석할 수 있는 최초의 상용 시스템을 제공합니다.
24웰에 걸친 자기 감지는 EMT 기능 발달에 대한 종단 연구를 실시간으로 용이하게 하고 화학적, 환경적 또는 유전자 조작에 대한 급성 반응을 정확하게 측정할 수 있습니다. 자기 감지는 여러 조직에서 동시에 측정할 수 있고 복잡한 데이터 분석이 필요하지 않은 몇 가지 장점이 있지만, 광학 감지 방법을 사용하면 칼슘 플럭스 또는 전압 매핑과 같은 생리학적 지표를 동시에 측정할 수 있습니다. 그러나 결과 섹션에 설명된 것과 같은 데이터 세트는 이 기술이 약물 개발 분야에서 가지고 있는 응용 프로그램의 폭을 보여줍니다. 시중에 나와 있는 분석법이 공학적 근육의 수축 출력을 직접 평가할 수 있는 수단을 제공한다는 점을 감안할 때 이러한 방법은 전임상 개발 파이프라인에 혁명을 일으킬 잠재력을 가지고 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작업은 식품의약국(U01 FD006676-01, 보건 및 환경 과학 연구소에 수여)과 국립 보건원(HL151094에서 Dr. Geisse)의 자금 지원으로 부분적으로 지원되었습니다. 이 원고를 준비하는 데 도움을 주신 Alec S. T. Smith 박사에게 감사드립니다.
100 µm cell strainer | CELLTREAT | 229485 | |
100 mm cell culture dish | ThermoFisher | 150466 | |
50 mL Steriflip filter | MilliporeSigma | SCGP00525 | |
500 mL filter flask | MilliporeSigma | S2GVU05RE | |
6-aminocaproic acid | Sigma | A2504 | |
B27 | Gibco | 17504044 | |
Cardiosight Maintenance Medium | NEXEL | CM-002A | |
Cardiosight Plating Medium | NEXEL | CM-020A | |
C-Pace EM stimulator | IonOptix | EM | |
Curi Bio Muscle Differentiation Media Kit | Primary – DIFF | ||
Curi Bio Muscle Maintenance Media Kit | Curi Bio | Primary – MAINT | |
DAPI | Invitrogen | D1306 | |
DMEM, high glucose, GlutaMAX | Gibco | 10566-016 | |
Dnase | Sigma | 11284932001 | |
DPBS | Gibco | 14190-250 | |
Dystrophin antibody | Abcam | ab154168 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | 10082147 | Must be heat-inactivated |
Fibrinogen (Bovine) | Sigma | E8630 | |
Glutaraldehyde | Sigma | 354400 | |
Ham's F10 | Gibco | 11550043 | |
Hemacytometer | Sigma | Z359629 | |
HS-27A Fibroblasts | ATCC | CRL-2496 | |
Human Skeletal Muscle Myoblasts | Lonza | CC-2580 | |
Luer Lock 0.2 µm syringe filter | Corning | 431219 | |
Luer Lock 10 mL syringe | BH Supplies | BH10LL | |
Mantarray Instrument | Curi Bio | MANTA-24-B1 | System |
Mantarray Plate Kits | Curi Bio | MA-24-SKM-5 | Pack of 5 kits |
Mantarray stimulation lid | Curi Bio | EM | |
Matrigel (ECM) | Corning | 356231 | |
Nexel Cardiosight-S, Cardiomyocytes | NEXEL | C-002 | |
Optical Microscope | Nikon Ti2E | MEA54000 | |
Pan Myosin Heavy Chain antibody | DSHB | MF-20 | |
Poly(ethyleneimine) | Sigma | P3143 | |
ROCK inhibitor | StemCell Technologies | Y-27632 | |
RPMI | Gibco | 11875-093 | |
Skeletal Muscle Growth Medium (SkGM-2) | Lonza | CC-3245 | |
Standard 24-well plates | Greiner | M8812 | Other manufacturer's plates will not fit |
Standard 6-well plates | ThermoFisher | 140675 | |
Stromal medium (DMEM + 20% FBS) | |||
T175 Filter Flask | ThermoFisher | 159910 | |
T225 Filter Flask | ThermoFisher | 159934 | |
Thrombin | Sigma | T4648 | |
Trypan Blue solution, 0.4% | ThermoFisher | 15250061 | |
TrypLE Select Enzyme (10x) | Thermo Scientific | A1217702 | |
TrypLE Select Enzyme (1x) | Thermo Scientific | 12563011 |