वर्तमान प्रोटोकॉल डाउनस्ट्रीम कार्यात्मक और संरचनात्मक विश्लेषण के लिए उनकी गुणवत्ता का आकलन करने के लिए झिल्ली प्रोटीन पर फ्लोरोसेंट आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एफएसईसी) करने की प्रक्रिया का वर्णन करता है। डिटर्जेंट-घुलनशील और डिटर्जेंट-मुक्त स्थितियों के तहत कई जी-प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (जीपीसीआर) के लिए एकत्र किए गए प्रतिनिधि एफएसईसी परिणाम प्रस्तुत किए गए हैं।
झिल्ली प्रोटीन संरचनात्मक स्पष्टीकरण और बायोफिज़िकल लक्षण वर्णन के दौरान, झिल्ली से निष्कर्षण के बाद एकत्रित नहीं होने वाले एक को खोजने के लिए विभिन्न टैग, ट्रंकेशन, विलोपन, संलयन साथी सम्मिलन और स्थिर उत्परिवर्तन वाले कई प्रोटीन संरचनाओं का परीक्षण करना आम है। इसके अलावा, डिटर्जेंट, एडिटिव, लिगैंड, या बहुलक को निर्धारित करने के लिए बफर स्क्रीनिंग जो झिल्ली प्रोटीन के लिए सबसे स्थिर स्थिति प्रदान करती है, एक महत्वपूर्ण अभ्यास है। फ्लोरोसेंट आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी द्वारा झिल्ली प्रोटीन की गुणवत्ता का प्रारंभिक लक्षण वर्णन प्रोटीन शुद्धिकरण की आवश्यकता के बिना विभिन्न संरचनाओं या स्थितियों का आकलन और रैंक करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है, और यह उपकरण नमूना आवश्यकता को भी कम करता है। झिल्ली प्रोटीन को फ्लोरोसेंटली टैग किया जाना चाहिए, आमतौर पर उन्हें जीएफपी टैग या इसी तरह से व्यक्त करके। प्रोटीन को सीधे पूरी कोशिकाओं से घुलनशील किया जा सकता है और फिर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा स्पष्ट रूप से स्पष्ट किया जा सकता है; बाद में, प्रोटीन को एक आकार बहिष्करण कॉलम में पारित किया जाता है, और एक फ्लोरोसेंट ट्रेस एकत्र किया जाता है। यहां, जीपीसीआर लक्ष्य स्फिंगोसिन -1-फॉस्फेट रिसेप्टर (एस1 पीआर 1) और सेरोटोनिन रिसेप्टर (5 एचटी2 एआर) पर एफएसईसी और प्रतिनिधि एफएसईसी डेटा चलाने के लिए एक विधि प्रस्तुत की गई है।
आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी), जिसे जेल निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी के रूप में भी जाना जाता है, आमतौर पर प्रोटीन विज्ञान1 में उपयोग किया जाता है। एसईसी के दौरान, प्रोटीन को उनके हाइड्रोडायनामिक त्रिज्या के आधार पर अलग किया जाता है, जो प्रोटीन आकार और आकार2 का एक कार्य है। संक्षेप में, यह पृथक्करण छिद्रपूर्ण मोतियों के पैक बिस्तर पर प्रवाह के तहत प्रोटीन के नमूनों को लागू करके प्राप्त किया जाता है जो आणविक छलनी के रूप में कार्य करते हैं। उपयोग किए जाने वाले मोती अक्सर छिद्र आकार की एक परिभाषित श्रेणी के साथ क्रॉस-लिंक्ड अगारोस होते हैं ताकि प्रोटीन को मोतियों 3,4,5,6,7 के छिद्रों में प्रवेश करने या बाहर रखने की अनुमति मिल सके। छोटे हाइड्रोडायनामिक त्रिज्या वाले प्रोटीन छिद्रों के भीतर अधिक अनुपात में समय बिताते हैं और इस प्रकार, धीमी दर से पैक किए गए बिस्तर के माध्यम से प्रवाहित होते हैं, जबकि बड़े प्रोटीन मोतियों (बहिष्कृत मात्रा) के बाहर अधिक अनुपात में समय बिताते हैं और तेज दर से पैक किए गए बिस्तर के माध्यम से चलते हैं। एसईसी का उपयोग प्रोटीन शुद्धिकरण चरण के रूप में किया जा सकता है जब एक प्रारंभिक कॉलम का उपयोग कियाजाता है। जब एक विश्लेषणात्मक कॉलम का उपयोग किया जाता है, तो एसईसी का उपयोग प्रोटीन की गुणवत्ता और गुणों का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकताहै। उदाहरण के लिए, प्रोटीन समुच्चय जो एक नमूने में मौजूद हो सकते हैं और खराब गुणवत्ता वाले प्रोटीन का संकेत देते हैं, वे बहुत बड़े होते हैं, जिसका अर्थ है कि वे केवल बहिष्कृत मात्रा में यात्रा करते हैं और इस प्रकार, शुरुआती बिंदु पर कॉलम से अलग हो जाते हैं; इस खंड को स्तंभ शून्य या शून्य मात्रा के रूप में जाना जाता है। इसके अलावा, आणविक भार मानकों का उपयोग कॉलम को कैलिब्रेट करने के लिए किया जा सकता है, जिससे रुचि के प्रोटीन के अनुमानित आणविक भार को एक मानक वक्र से इंटरपोलेट किया जा सकता है।
आमतौर पर, 280 एनएम पर प्रोटीन अवशोषण का उपयोग आकार बहिष्करण कॉलम से प्रोटीन क्षालन की निगरानी के लिए किया जाता है। यह एक विश्लेषण उपकरण के रूप में एसईसी के उपयोग को प्रतिबंधित करता है जब तक कि रुचि का प्रोटीन काफी हद तक दूषित प्रोटीन से मुक्त नहीं होता है, उदाहरण के लिए, प्रोटीन शुद्धिकरण के अंतिम चरण में। हालांकि, फ्लोरोसेंट एसईसी (एफएसईसी) रुचि के प्रोटीन का उपयोग करता है जिसे फ्लोरोसेंटली लेबल किया जाता है। इसलिए, एक फ्लोरोसेंट सिग्नल का उपयोग विशेष रूप से अन्य प्रोटीन या यहां तक कि कच्चे मिश्रण 8,9 की उपस्थिति में रुचि के प्रोटीन के क्षालन की निगरानी के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, चूंकि फ्लोरोसेंट सिग्नल अत्यधिक संवेदनशील होते हैं, इसलिए बेहद कम प्रोटीन मात्रा वाले नमूनों पर सफल विश्लेषण किया जा सकता है। रुचि के प्रोटीन को अक्सर अभिव्यक्ति निर्माण में हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) या उन्नत जीएफपी (ईजीएफपी) टैग को शामिल करके फ्लोरोसेंटली लेबल किया जाता है। फ्लोरोसेंट सिग्नल को तब 395 एनएम या 488 एनएम पर उत्तेजना द्वारा निगरानी की जा सकती है और जीएफपी या ईजीएफपी के लिए क्रमशः 509 एनएम या 507 एनएम पर फ्लोरोसेंट उत्सर्जन का पता लगाया जासकता है।
एसईसी कॉलम से प्रोटीन क्षालन की निगरानी के लिए फ्लोरोसेंट सिग्नल का उपयोग करने का लाभ एफएसईसी को झिल्ली प्रोटीन नमूनों का विश्लेषण करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण बनाता है जब घुलनशील प्रोटीन की तुलना में अभिव्यक्ति का स्तर विशेष रूप से खराब होता है। महत्वपूर्ण रूप से, झिल्ली प्रोटीन की गुणवत्ता और गुणों का विश्लेषण सीधे कच्चे लाइसेट से घुलनशीलता के बाद किया जा सकता है, बिना शुद्धिकरण प्रक्रिया को अनुकूलित करने की आवश्यकताके 11,12। इन कारणों से, एफएसईसी का उपयोग झिल्ली प्रोटीन की गुणवत्ता का तेजी से विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है, जबकि विभिन्न कारकों की खोज की जा सकती है जो समाधान में झिल्ली प्रोटीन के व्यवहार में सुधार के लिए आवश्यक हो सकते हैं। उदाहरण के लिए, विभिन्न टैग, ट्रंकेशन, विलोपन, संलयन साथी सम्मिलन और स्थिर उत्परिवर्तन वाले कई निर्माणों का परीक्षण करना आम है ताकि एक ऐसा मिल सके जो झिल्ली13,14 से निष्कर्षण के बाद एकत्रित नहीं होता है। इसके अलावा, डिटर्जेंट, एडिटिव, लिगैंड, या बहुलक को निर्धारित करने के लिए बफर स्क्रीनिंग जो झिल्ली प्रोटीन के लिए सबसे स्थिर स्थिति प्रदान करती है, प्रोटीन शुद्धिकरण के लिए सबसे अच्छी बफर संरचना को परिभाषित कर सकती है या डाउनस्ट्रीम उपयोगों के लिए स्थिरता प्रदान कर सकती है, जैसे कि बायोफिज़िकल परख या संरचनात्मक लक्षण वर्णन।
इस प्रकार, एफएसईसी विधि का समग्र लक्ष्य रुचि के लक्ष्य झिल्ली प्रोटीन के लिए एसईसी कॉलम क्षालन प्रोफ़ाइल एकत्र करना है। इसके अलावा, जैसा कि प्रतिदीप्ति का उपयोग किया जाता है, इस एसईसी ट्रेस को किसी भी लंबे शुद्धिकरण से पहले संरचनाओं और स्थितियों के अनुकूलन में जल्द से जल्द संभव बिंदु पर एकत्र किया जाता है। एफएसईसी ट्रेस का उपयोग विभिन्न बफर स्थितियों या झिल्ली प्रोटीन संरचनाओं के साथ झिल्ली प्रोटीन को शुद्ध करने की सफलता की संभावना का न्याय करने के लिए एक तुलनात्मक उपकरण के रूप में किया जा सकता है। इस तरह, एफएसईसी प्रोफाइल के संग्रह का उपयोग अन्य विश्लेषण विधियों के लिए आवश्यक शुद्ध प्रोटीन की मात्रा उत्पन्न करने के प्रयास से पहले इष्टतम निर्माण डिजाइन और बफर संरचना पर पहुंचने के लिए एक त्वरित पुनरावृत्ति प्रक्रिया के रूप में किया जा सकता है।
एफएसईसी के साथ स्थिति स्क्रीनिंग के लिए सामान्य व्यवस्थित दृष्टिकोण जो यहां प्रस्तुत किए गए हैं, झिल्ली प्रोटीन के उत्पादन के लिए घुलनशीलता और शुद्धिकरण मापदंडों के तेजी से अनुकूलन की अनुमति देते हैं। इसका मतलब है कि बायोफिज़िकल और संरचनात्मक अध्ययन के लिए स्थिर और कार्यात्मक रूप से सक्रिय झिल्ली प्रोटीन का तेजी से उत्पादन किया जा सकता है। इसके अलावा, एफएसईसी को प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग करके चलाया जा सकता है जो संभवतः झिल्ली प्रोटीन प्रयोगशालाओं में पहले से ही मौजूद हैं, और इस प्रकार, परख चलाने के लिए एक विशेषज्ञ उपकरण की खरीद की कोई आवश्यकता नहीं है।
महत्वपूर्ण कदम
डिटर्जेंट में कोशिकाओं से घुलनशीलता के बिंदु से उस बिंदु तक का समय लगता है जिस पर नमूना एसईसी कॉलम (चरण 2.1.5-3.2.5) से गुजरता है, समय महत्वपूर्ण है, और इन चरणों के बीच कोई विराम नहीं होना चाहिए। सभी चरणों को 4 डिग्री सेल्सियस या बर्फ पर आयोजित किया जाना चाहिए, और इन चरणों को करने में लगने वाले समय को न्यूनतम संभव रखने की आवश्यकता है। किसी भी संभावित प्रकटन या गिरावट से पहले झिल्ली प्रोटीन के लिए एफएसईसी प्रोफाइल को रिकॉर्ड करने के लिए ये समय और तापमान की बाधाएं आवश्यक हैं। झिल्ली प्रोटीन को घुलनशील होने के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर भी प्रकट, एकत्रीकरण और गिरावट का अधिक जोखिम होता है। आदर्श रूप से, कोई भी नमूना जिसके लिए एफएसईसी निशान की तुलना की जानी है, उसे घुलनशीलता चरण के बाद उसी समय में एसईसी कॉलम को पारित करना चाहिए। व्यवहार में, यह मुश्किल है, खासकर अगर नमूने एक कॉलम के नीचे क्रमिक रूप से पारित किए जाते हैं, लेकिन एक दूसरे के 3 घंटे के भीतर पांच एसईसी निशान एकत्र करना संभव है, और इस समय सीमा में, महत्वपूर्ण गिरावट नहीं होनी चाहिए।
समस्या निवारण
यदि, एफएसईसी प्रयोग करने पर, कम या कोई फ्लोरोसेंट सिग्नल नहीं है, तो यह संभव है कि रुचि के झिल्ली प्रोटीन ने चुनी हुई सेल लाइन को व्यक्त नहीं किया है, चुने हुए सेल लाइन की बहुत कम अभिव्यक्ति है, या चुने हुए डिटर्जेंट में घुलनशील नहीं किया गया है। यदि प्रतिदीप्ति संकेत एकत्र करने और एफएसईसी ट्रेस को रिकॉर्ड करने से पहले नमूनों को पतला किया गया था, तो एक सरल पहला कदम एसईसी अंशों को कम कमजोर करने या कमजोर करने की कोशिश करना होगा। यदि यह अभी भी एक व्याख्या योग्य एफएसईसी ट्रेस नहीं देता है, तो प्रोटीन की अभिव्यक्ति और घुलनशीलता की जांच की जानी चाहिए।
चरण 2.2.2 के बाद नमूने की प्रतिदीप्ति की जांच करके प्रोटीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण प्राप्त किया जा सकता है। यदि इस नमूने से बहुत कम या कोई फ्लोरोसेंट सिग्नल नहीं है (उदाहरण के लिए, पृष्ठभूमि के बहुत करीब एक संकेत), तो प्रोटीन अभिव्यक्ति के साथ एक समस्या होने की संभावना है। झिल्ली प्रोटीन के अभिव्यक्ति स्तर में सुधार के लिए कदम उठाए जा सकते हैं, जैसे कि एक वैकल्पिक सेल लाइन पर स्विच करना या विकास की स्थिति को समायोजित करना, अभिव्यक्ति का प्रेरण, और प्रेरण / संक्रमण / अभिकर्मक और फसल के बीच का समय। हालांकि, विशेष रूप से खराब प्रोटीन अभिव्यक्ति एक अस्थिर झिल्ली प्रोटीन का संकेत दे सकती है और इस प्रकार, एक खराब निर्माण विकल्प।
यदि अभिव्यक्ति की जांच की गई है और एफएसईसी से पहले पृष्ठभूमि के ऊपर एक स्पष्ट फ्लोरोसेंट सिग्नल है, तो चरण 2.2.2 (कुल प्रोटीन) के बाद नमूने की तुलना में चरण 2.4.3 (घुलनशील झिल्ली प्रोटीन) के बाद नमूने के शेष फ्लोरोसेंट सिग्नल को मापकर घुलनशीलता दक्षता की जांच की जा सकती है। घुलनशीलता दक्षता के लिए 20% -30% होना आम है और अभी भी झिल्ली प्रोटीन के सफल विश्लेषण और शुद्धिकरण की अनुमति देता है। हालांकि, यदि घुलनशीलता दक्षता 20% से कम है, तो घुलनशीलता या विभिन्न घुलनशीलता स्थितियों के लिए एक अलग डिटर्जेंट की आवश्यकता हो सकती है। यदि घुलनशीलता में सुधार के प्रयास सफल नहीं होते हैं, तो यह एक विशेष रूप से अस्थिर झिल्ली प्रोटीन का संकेत दे सकता है और इस प्रकार, एक खराब निर्माण विकल्प।
यदि एफएसईसी ट्रेस (जैसे, 18-24 एमएल) में बहुत देर से एल्यूटिंग पीक देखा जाता है, तो यह इंगित करता है कि फ्लोरोसेंट प्रोटीन में प्रोटीन आणविक भार होता है जो अपेक्षा से बहुत कम होता है। यह ब्याज के झिल्ली प्रोटीन के अवक्रमित होने के कारण हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप “मुक्त” जीएफपी हो सकता है। किसी को यह जांचना चाहिए कि क्या प्रोटीन इन-जेल जीएफपी फ्लोरेसेंस का उपयोग करके घुलनशीलता से पहले और बाद में बरकरार है। यदि रुचि का प्रोटीन कम हो रहा है या प्रोटियोलाइज्ड है, तो प्रोटीज अवरोधक की मात्रा को दो गुना से चार गुना तक बढ़ाया जा सकता है। हालांकि, घुलनशीलता से पहले भी प्रोटीज या अवक्रमित प्रोटीन के प्रति उच्च संवेदनशीलता एक विशेष रूप से अस्थिर प्रोटीन का संकेत दे सकती है और इस प्रकार, एक खराब निर्माण विकल्प।
FSEC के संशोधन और आगे अनुप्रयोग
आमतौर पर, एफएसईसी में उपयोग किया जाने वाला फ्लोरोसेंट टैग जीएफपी या ईजीएफपी है, जैसा कि इस प्रोटोकॉल में वर्णित है। हालांकि, कई अलग-अलग फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग उपलब्ध हैं। उपयोग किए जाने वाले फ्लोरोसेंट टैग की पसंद एक प्लेट रीडर होने पर निर्भर करती है जो चयनित फ्लोरोसेंट टैग के लिए फ्लोरोसेंट सिग्नल रिकॉर्ड करने के लिए सही उत्तेजना और उत्सर्जन मापदंडों को प्राप्त कर सकती है और विभिन्न पर्यावरणीय परिस्थितियों में क्वांटम उपज में बहुत कम बदलाव के साथ फ्लोरोफोरे हो सकती है। इसके अलावा, एफएसईसी फ्लोरोसेंट प्रोटीन तक ही सीमित नहीं है, लेकिन एक प्रोटीन के साथ भी समान रूप से अच्छी तरह से काम कर सकता है जिसे फ्लोरोसेंट डाई के साथ लेबल किया गया है। उदाहरण के लिए, एक एनटीए डाई का उपयोग किया जा सकता है, जो हिस्टिडाइन-टैग झिल्ली प्रोटीन संरचनाओं से अनुकूल रूप से बंधेगा। इसके अलावा, या तो फ्लोरोसेंट डाई के साथ रासायनिक रूप से लेबल किया गया एक फ्लोरोसेंट लेबल एंटीबॉडी और रुचि के झिल्ली प्रोटीन को बांधने के लिए विशिष्ट या झिल्ली प्रोटीन निर्माण में शामिल शुद्धिकरण टैग अप्रत्यक्ष रूप से एफएसईसी के लिए एक लक्ष्य लेबल कर सकता है।
एफएसईसी का उपयोग करके डिटर्जेंट स्क्रीनिंग करते समय, इस बारे में एक विकल्प बनाया जा सकता है कि एसईसी कॉलम को चलाने के लिए उपयोग किए जाने वाले बफर में मिलान डिटर्जेंट होना चाहिए या क्या सभी रन में एक मानक डिटर्जेंट का उपयोग किया जाना चाहिए। प्रोटीन के व्यवहार का अधिक सटीक प्रतिनिधित्व प्राप्त किया जाएगा यदि पूरे प्रयोग को मिलान डिटर्जेंट के साथ किया जाता है। हालांकि, यह समय लेने वाला और डिटर्जेंट की बर्बादी हो सकता है यदि कॉलम को प्रत्येक रन करने से पहले एक नए डिटर्जेंट में फिर से जोड़ा जाना चाहिए। इसके अलावा, जैसा कि डिटर्जेंट स्क्रीनिंग का मुख्य उद्देश्य निशान की तुलना करना है, रुझान निशान में बने रहेंगे, भले ही स्थितियां आदर्श न हों। इस प्रकार, एक समझौता किया जा सकता है जिससे प्रोटीन को ब्याज के डिटर्जेंट में घुलनशील किया जाता है, लेकिन कॉलम को सभी रन (जैसे, डीडीएम) 11 में एकल डिटर्जेंट के साथ एक मानक बफर में चलाया जाता है, जो समय और डिटर्जेंट उपभोग्य सामग्रियों को बचा सकता है।
उपयोग किए गए एफएलपीसी उपकरण को संशोधित करके, एफएसईसी प्रोटोकॉल के थ्रूपुट को काफी बढ़ाया जा सकता है, और नमूना आवश्यकता को कम किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एक एफपीएलसी या एचपीएलसी प्रणाली को एक ऑटोसैंपलर, एक छोटे बेड वॉल्यूम विश्लेषणात्मक कॉलम (जैसे 3.2 एमएल विश्लेषणात्मक एसईसी कॉलम), और कॉलम से सीधे निरंतर एफएसईसी निशान की निगरानी के लिए एक इन-लाइन फ्लोरोसेंट डिटेक्टर से लैस किया जा सकता है। परिणामी सेटअप कम समय में अधिक एफएसईसी रन करने की अनुमति देगा और मैन्युअल प्लॉटिंग चरण को हटा देगा, इस प्रकार कम समय सीमा में अधिक संख्या में स्थितियों का परीक्षण करने की अनुमति देगा। इसके अलावा, नमूना आवश्यकता को और कम किया जाएगा, क्योंकि प्रत्येक रन के लिए एफएसईसी कॉलम पर कम नमूने तैयार और लोड किए जाने होंगे। यह अभिव्यक्ति संस्कृतियों को प्लेट-आधारित प्रारूप में कम करने की संभावनाओं को खोल देगा, क्योंकि विश्लेषण के लिए ऐसी कम सामग्री की आवश्यकता होगी।
अन्य तरीकों की तुलना में एफएसईसी की ताकत और कमजोरियां
एफएसईसी का एक नुकसान यह है कि झिल्ली प्रोटीन संरचनाओं को फ्लोरोसेंट लेबल पेश करने के लिए डिज़ाइन करने की आवश्यकता होती है, और परिचय पर, एक छोटी सी संभावना है कि लेबल का प्लेसमेंट रुचि के झिल्ली प्रोटीन के कार्य या तह में हस्तक्षेप कर सकता है। इसके अलावा, एफएसईसी प्रोटोकॉल, जैसा कि यहां वर्णित है, सेल लाइसेट की उपस्थिति में एक झिल्ली प्रोटीन की विशेषताओं की निगरानी करता है, जो प्रोटीन का एक कच्चा मिश्रण है। इस वातावरण में एक झिल्ली प्रोटीन का व्यवहार उस समय से भिन्न हो सकता है जब रुचि के झिल्ली प्रोटीन को अन्य प्रोटीनों से पूरी तरह से अलग होने पर शुद्धिकरण के अंत में एक प्रारंभिक एसईसी कॉलम के अधीन किया जाता है। इसके अलावा, एफएसईसी प्रोटीन की गुणवत्ता का कुछ गुणात्मक उपाय प्रदान करता है। हालांकि, एफएसईसी ट्रेस को मोनोडिस्पर्सिटी इंडेक्स में परिवर्तित करके, जैसा कि प्रोटोकॉल के चरण 4.3.3 में वर्णित है, प्रोटीन की गुणवत्ता का एक मात्रात्मक माप प्राप्त किया जा सकता है।
एफएसईसी एकमात्र विधि नहीं है जिसका उपयोग झिल्ली प्रोटीन संरचनाओं, घुलनशीलता की स्थिति और शुद्धिकरण बफर संरचना के शुरुआती विश्लेषण में किया जा सकता है। वैकल्पिक दृष्टिकोणों में एफएसईसी पर फायदे और नुकसान दोनों हैं। उदाहरण के लिए, फ्लोरोफोरे-आधारित थर्मोस्टेबिलिटी परख मौजूद हैं, विशेष रूप से डाई 7-डायथाइलमिनो-3-(4′-मेलिमिडिलफेनिल)-4-मिथाइलकौमेरिन (सीपीएम) 16,17 का उपयोग। इस विधि का लाभ यह है कि, एफएसईसी के विपरीत, जो प्रोटीन की गुणवत्ता का गुणात्मक माप प्रदान करता है, थर्मोस्टेबिलिटी परख सापेक्ष पिघलने के तापमान के रूप में एक मात्रात्मक माप प्रदान करते हैं। इसके अलावा, प्रोटीन निर्माण पर फ्लोरोसेंट टैग पेश करने की कोई आवश्यकता नहीं है। हालांकि, एफएसईसी की तुलना में थर्मोस्टेबिलिटी परख के नुकसान यह हैं कि शुद्ध प्रोटीन का उपयोग किया जाना चाहिए और परख सभी प्रोटीन संरचनाओं के साथ संगत नहीं है, क्योंकि यह मुड़े हुए प्रोटीन में देशी सिस्टीन अवशेषों की लाभप्रद स्थितियों पर निर्भर करता है।
एक और विधि जिसमें एफएसईसी और फ्लोरोफोरे-आधारित थर्मोस्टेबिलिटी परख दोनों के साथ समानताएं हैं, एक परख है जो झिल्ली प्रोटीन की तापमान संवेदनशीलता को मापती है। इस परख में, प्रोटीन को विभिन्न तापमानों के साथ चुनौती दी जाती है, और सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद समाधान में रहने वाले प्रोटीन का पता लगाया जाता है। इस पद्धति में पता लगाने का कई तरीकों से आयोजन किया गया है, जिसमें समाधान18 में प्रतिदीप्ति को मापना, एसडीएस-पेज जेल बैंड19 की प्रतिदीप्ति, या पश्चिमी धब्बा20 में सिग्नल तीव्रता शामिल है। हालांकि, इन दृष्टिकोणों का एक महत्वपूर्ण नुकसान यह है कि परख बहुत श्रम-गहन है और परिणामों में उच्च शोर से ग्रस्त है, क्योंकि प्रत्येक व्यक्तिगत तापमान बिंदु को स्वतंत्र रूप से एकत्र किया जाना चाहिए।
अंत में, कई और उन्नत बायोफिज़िकल तकनीकों का उपयोग एफएसईसी के समान तरीके से झिल्ली प्रोटीन की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, प्रवाह-प्रेरित फैलाव विश्लेषण21, माइक्रोस्केल थर्मोफोरेसिस22, या एसपीआर। यद्यपि बहुत शक्तिशाली दृष्टिकोण हैं, इन विधियों का नुकसान विश्लेषण चलाने के लिए अत्यधिक विशिष्ट उपकरणों की आवश्यकता है।
निष्कर्ष में, एफएसईसी झिल्ली प्रोटीन उत्पादन अभियानों में उपयोग के लिए एक अमूल्य उपकरण प्रदान करता है, और हालांकि यह एकमात्र विकल्प नहीं है, लेकिन ऊपर सूचीबद्ध अन्य तरीकों पर इसके कई अलग-अलग फायदे हैं। ऑर्थोगोनल परख द्वारा परिणामों के क्रॉस-सत्यापन की हमेशा सिफारिश की जाती है, और ऊपर चर्चा की गई विधियों में से कोई भी पारस्परिक रूप से एक दूसरे से अनन्य नहीं है।
The authors have nothing to disclose.
हम पूरी पीक प्रोटीन टीम की मदद और समर्थन को स्वीकार करना चाहते हैं। सेल विज्ञान टीम से, हम कीट सेल अभिव्यक्ति में अपनी मूल्यवान अंतर्दृष्टि और मार्गदर्शन के लिए इयान हैम्पटन को स्वीकार करना चाहते हैं। हम इस परियोजना को आगे बढ़ाने के लिए संसाधन और अवसर प्रदान करने के लिए मार्क एबॉट को धन्यवाद देना चाहते हैं।
1 mL and 5 mL plastic syringes | Generic | - | Syringes for transfer of samples |
10x EDTA Free Protease inhibitor cocktail | Abcam | ab201111 | Protease inhibitors |
15 mL tubes | Generic | - | 15 mL tubes for pellet preparation and solubilisation |
2 mL ultra-centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344625 | Tubes for ultra-centrifuge rotor |
50 mL tubes | Generic | - | 50 mL tubes for cell harvest |
96 deep-well blocks | Greiner | 15922302 | For collecting 0.2 mL SEC fractions |
ÄKTA V9-L loop valve | Cytiva | 29011358 | 5 posiiton loop valve for the ÄKTA FPLC system |
ÄKTA F9-C fraction collector | Cytiva | 29027743 | 6 position plate fraction collector for the ÄKTA FPLC system |
ÄKTA pure 25 L | Cytiva | 29018224 | FPLC system for running the experiment |
Benchtop centrifuge (e.g. Fisherbrand GT4 3L) | Fisher Scientific | 15828722 | Centrifuge for low-speed spin |
Blunt end filling needles | Generic | - | For transfer of samples |
Bottle top vacuum filter | Corning | 10005490 | Bottle top vacuum filter for filtering SEC buffers |
Cholesteryl hemisuccinate (CHS) | Generon | CH210-5GM | Additive for detergent solubilisation |
Disposable multichannel reseviour | Generic | - | Resevior for addition of water or buffer to 96-well micro-plate |
Dodecyl maltoside (DDM) | Glycon | D97002-C-25g | Detergent for solubilisation |
eGFP protein standards | BioVision | K815-100 | eGFP standards for fluorescent calibration curve |
Glycerol | Thermo Scientific | 11443297 | Glycerol for buffer preparation |
HEPES | Thermo Scientific | 10411451 | HEPES for buffer preparation |
High molecular weight SEC calibration standards kit | Cytiva | 28403842 | Molecular weight calibration kit for SEC |
Lauryl maltose neopentylglycol (LMNG) | Generon | NB-19-0055-5G | Detergent for solubilisation |
Low molecular weight SEC calibration standards kit | Cytiva | 28403841 | Molecular weight calibration kit for SEC |
MLA-130 ultra-centrifuge rotor | Beckman Coulter | 367114 | Rotor for ultracentrifuge that fits 2 mL capacity tubes |
Opaque 96-well flat-bottom micro-plate | Corning | 10656853 | 96-well for reading fluorescent signal in plate reader |
Optima MAX-XP ultra-centrifuge | Beckman Coulter | 393315 | Centrifuge for high-speed spin |
pH meter | Generic | - | For adjusting the pH of buffers during preparation |
Prism | GraphPad | - | Graphing software for plotting traces |
Rotary mixer | Fisher Scientific | 12027144 | Mixer for end over end mixing in the cold |
Sodium chloride | Fisher Scientific | 10316943 | Sodium chloride for buffer preparation |
Sodium hydroxide | Fisher Scientific | 10488790 | Sodium hydroxide for buffer preparation |
Spectramax ID3 Plate Reader | Molecular Devices | 735-0391 | Micro-plate reader capable of reading fluorescence |
Stirrer plate | Generic | - | For stirring buffers during preparation |
Styrene maleic acid (SMA) | Orbiscope | SMALP 300 | Polymer for detergent free extraction |
Superdex 200 Increase 10/300 GL | Cytiva | 28990944 | SEC column for running the experiment. The bed volume of this column is 24 mL. The recommended flow rate for this column in 0.9 ml/min (in water at 4 °C). The maximum pressure limit for this column is 5 MPa. |
Vacuum pump | Sartorius | 16694-2-50-06 | For filtering and degassing buffers |