本协议描述了对膜蛋白进行荧光体积排阻色谱(FSEC)的程序,以评估其用于下游功能和结构分析的质量。介绍了在洗涤剂溶解和无洗涤剂条件下收集的几种G蛋白偶联受体(GPCR)的代表性FSEC结果。
在膜蛋白结构解析和生物物理表征过程中,通常会尝试许多包含不同标签、截断、缺失、融合伴侣插入和稳定突变的蛋白质构建体,以找到从膜中提取后未聚集的蛋白质构建体。此外,缓冲液筛选以确定为膜蛋白提供最稳定条件的去垢剂、添加剂、配体或聚合物是一项重要的实践。通过荧光体积排阻色谱法对膜蛋白质量进行早期表征提供了一种强大的工具,无需蛋白质纯化即可评估和分级不同的构建体或条件,并且该工具还最大限度地减少了样品需求。膜蛋白必须进行荧光标记,通常通过用GFP标签或类似标签表达它们。蛋白质可以直接从全细胞中溶解,然后通过离心粗略澄清;随后,将蛋白质传递到尺寸排阻柱中,并收集荧光痕量。本文介绍了一种运行FSEC的方法,并在GPCR靶向鞘氨醇-1-磷酸受体(S1PR1)和5-羟色胺受体(5HT2AR)上具有代表性的FSEC数据。
体积排阻色谱(SEC),也称为凝胶过滤色谱法,通常用于蛋白质科学1。在SEC期间,蛋白质根据其流体动力学半径进行分离,该半径是蛋白质大小和形状的函数2。简而言之,这种分离是通过将流动下的蛋白质样品施加到充当分子筛的多孔珠子填充床上来实现的。使用的磁珠通常是交联琼脂糖,具有确定的孔径范围,以允许蛋白质进入或排除珠子的孔3,4,5,6,7。具有较小流体动力学半径的蛋白质在孔内花费的时间比例更大,因此以较慢的速度流过填充床,而较大的蛋白质在珠子外花费的时间比例更大(排除的体积)并以更快的速度通过填充床。当使用制备柱时,SEC可用作蛋白质纯化步骤1。当使用分析柱时,SEC可用于分析蛋白质的质量和性质2。例如,样品中可能存在的蛋白质聚集体表明蛋白质质量差,往往非常大,这意味着它们仅在排除的体积中移动,因此最早从色谱柱中洗脱;此体积称为列空隙或空隙体积。此外,分子量标准品可用于校准色谱柱,允许从标准曲线插值目标蛋白质的估计分子量。
通常,280 nm处的蛋白质吸光度用于监测尺寸排阻柱的蛋白质洗脱。这限制了SEC作为分析工具的使用,直到目标蛋白质基本上没有污染蛋白质,例如,在蛋白质纯化的最后一步。然而,荧光SEC(FSEC)利用荧光标记的目标蛋白质。因此,荧光信号可用于在其他蛋白质甚至粗混合物存在的情况下特异性监测目标蛋白质的洗脱情况8,9。此外,由于荧光信号高度灵敏,因此可以对蛋白质含量极低的样品进行成功的分析。目标蛋白通常通过在表达构建体中加入绿色荧光蛋白(GFP)或增强型GFP(eGFP)标签进行荧光标记。然后可以通过在395nm或488nm处激发荧光信号来监测荧光信号,并分别检测GFP或eGFP在509nm或507nm处的荧光发射10。
使用荧光信号监测SEC色谱柱的蛋白质洗脱的优点使FSEC成为分析膜蛋白样品的宝贵工具,当表达水平与可溶性蛋白相比特别差时。至关重要的是,膜蛋白的质量和性质可以在从粗裂解物中溶解后直接进行分析,而无需首先优化纯化过程11,12。由于这些原因,FSEC可用于快速分析膜蛋白质量,同时探索改善溶液中膜蛋白行为可能需要的不同因素。例如,通常会尝试包含不同标签、截断、缺失、融合伴侣插入和稳定突变的大量构建体,以找到从膜中提取后未聚集的构建体13,14。此外,缓冲液筛选以确定为膜蛋白提供最稳定条件的去垢剂、添加剂、配体或聚合物,可以确定蛋白质纯化或为下游用途(如生物物理测定或结构表征)提供稳定性的最佳缓冲液组成。
因此,FSEC方法的总体目标是收集目标膜蛋白的SEC色谱柱洗脱曲线。此外,由于使用荧光,在进行任何长时间的纯化之前,在优化构建体和条件的尽可能早的点收集该SEC迹线。FSEC痕量可用作比较工具,以判断使用不同缓冲条件或膜蛋白构建体纯化膜蛋白的成功可能性。通过这种方式,FSEC图谱的收集可以用作快速迭代过程,以在花费精力生成其他分析方法所需的纯蛋白质量之前获得最佳构建体设计和缓冲液组成。
这里介绍的FSEC条件筛选通用系统方法允许快速优化膜蛋白生产的增溶和纯化参数。这意味着可以快速生产稳定且具有功能活性的膜蛋白,用于生物物理和结构研究。此外,FSEC可以使用膜蛋白实验室中可能已经到位的实验室设备进行运行,因此,无需购买专业仪器即可运行测定。
关键步骤
从去垢剂中的细胞溶解点到样品通过SEC色谱柱(步骤2.1.5-3.2.5)所需的时间是时间关键,这些步骤之间不得有停顿。所有步骤都应在4°C或冰上进行,并且执行这些步骤所需的时间需要保持在尽可能少。这些时间和温度限制对于在任何潜在的展开或降解之前记录膜蛋白的FSEC谱是必要的。膜蛋白溶解后,即使在4°C下,也存在更大的展开,聚集和降解风险。理想情况下,要比较FSEC迹线的任何样品都应在增溶步骤后的相同时间内通过SEC色谱柱。在实践中,这很困难,特别是如果样品按顺序沿单根色谱柱向下传递,但可以在3小时内收集多达5条SEC迹线,并且在此时间范围内,不应有明显的降解。
故障 排除
如果在进行FSEC实验时,荧光信号低或没有荧光信号,则目标膜蛋白可能未表达所选细胞系,所选细胞系的表达非常低,或者未溶解在所选去垢剂中。如果在收集荧光信号并记录FSEC迹线之前稀释样品,则简单的第一步是尝试较低的稀释度或不稀释SEC馏分。如果这仍然不能产生可解释的FSEC痕迹,则应检查蛋白质的表达和溶解。
蛋白质表达的分析可以通过在步骤2.2.2之后检查样品的荧光来实现。如果该样品的荧光信号非常低或没有荧光信号(例如,非常接近背景的信号),则蛋白质表达可能存在问题。可以采取措施提高膜蛋白的表达水平,例如切换到替代细胞系或调整生长条件、诱导表达以及诱导/感染/转染与收获之间的时间。然而,特别差的蛋白质表达可能表明膜蛋白不稳定,因此构建体选择不佳。
如果在FSEC之前已经检查了表达并且背景上方有清晰的荧光信号,则可以通过测量步骤2.4.3(可溶性膜蛋白)后样品的剩余荧光信号与步骤2.2.2(总蛋白)之后的样品进行比较来检查增溶效率。溶解效率通常为20%-30%,并且仍然可以成功分析和纯化膜蛋白。但是,如果增溶效率低于20%,则可能需要不同的去溶剂进行增溶或不同的增溶条件。如果改善增溶性的尝试不成功,这可能表明膜蛋白特别不稳定,因此构建体选择不佳。
如果在FSEC痕量中观察到非常晚的洗脱峰(例如,18-24 mL),则表明荧光蛋白的蛋白质分子量远低于预期。这可能是由于感兴趣的膜蛋白被降解,导致“游离”GFP。应使用凝胶内GFP荧光在溶解前后检查蛋白质是否完整。如果感兴趣的蛋白质确实看起来正在降解或被蛋白水解,蛋白酶抑制剂的量可以增加两倍至四倍。然而,即使在溶解之前,对蛋白酶或降解蛋白的高敏感性也可能表明蛋白质特别不稳定,因此构建体选择不佳。
FSEC的修改和进一步应用
通常,FSEC中使用的荧光标签是GFP或eGFP,如本协议中所述。然而,有许多不同的荧光蛋白标签可用。要使用的荧光标签的选择取决于具有能够实现正确激发和发射参数的酶标仪,以记录所选荧光标签的荧光信号,并且具有在不同环境条件下量子产率几乎没有变化的荧光团。此外,FSEC不仅限于荧光蛋白,还可以与用荧光染料标记的蛋白质同样有效。例如,可以使用NTA染料,该染料将有利地与组氨酸标记的膜蛋白构建体结合。此外,用荧光染料化学标记并特异性结合目标膜蛋白的荧光标记抗体或膜蛋白构建体中包含的纯化标签都可以间接标记FSEC的靶标。
使用FSEC进行去垢剂筛选时,可以选择用于运行SEC色谱柱的缓冲液是否应包含蛋白质已溶解的匹配去垢剂,或者是否应在所有运行中使用标准去垢剂。如果整个实验全程使用匹配的洗涤剂进行,则将获得蛋白质行为的更准确表示。但是,如果在每次运行之前必须在新的洗涤剂中重新平衡色谱柱,则可能会非常耗时且浪费去垢剂。此外,由于洗涤剂筛选的主要目的是比较迹线,因此即使条件不理想,趋势也会保留在迹线中。因此,可以达成折衷方案,即蛋白质溶解在目标去垢剂中,但色谱柱在所有运行过程中使用单一去垢剂在标准缓冲液中运行(例如DDM)11,这可以节省时间和去垢剂耗材。
通过修改所使用的FLPC设备,可以显著提高FSEC方案的通量,并将样品需求降至最低。例如,FPLC或HPLC系统可以配备自动进样器、较小的床体积分析柱(例如3.2 mL分析SEC色谱柱)和在线荧光检测器,用于直接从色谱柱监测连续的FSEC迹线。由此产生的设置将允许在更短的时间内执行更多的FSEC运行,并消除手动绘图步骤,从而允许在更短的时间内测试更多的条件。此外,样品要求将进一步降低,因为每次运行需要制备和加载到FSEC色谱柱上的样品更少。这将为将表达培养物减少到基于板的形式开辟可能性,因为分析所需的材料很少。
与其他方法相比,FSEC的优势和劣势
FSEC的一个缺点是需要设计膜蛋白构建体以引入荧光标记,并且在引入时,标记物的位置可能会干扰目标膜蛋白的功能或折叠的可能性很小。此外,如此处所述,FSEC方案在细胞裂解物(蛋白质的粗混合物)存在下监测膜蛋白的特性。膜蛋白在这种环境中的行为可能与在纯化结束时将目标膜蛋白与其他蛋白质完全分离时经受制备型SEC色谱柱时的行为不同。此外,FSEC提供了蛋白质质量的定性衡量标准。然而,通过将FSEC痕量转换为单分散指数,如协议的步骤4.3.3中所述,可以获得蛋白质质量的定量测量。
FSEC并不是唯一可用于膜蛋白构建体、增溶条件和纯化缓冲液组成的早期分析的方法。与FSEC相比,替代方法既有优点也有缺点。例如,存在基于荧光团的热稳定性测定,特别是使用染料7-二乙氨基-3-(4′-马来酰亚胺基苯基)-4-甲基香豆素(CPM)16,17。这种方法的优点是,与提供蛋白质质量定性测量的FSEC不同,热稳定性测定以相对熔解温度的形式提供定量测量。此外,不需要在蛋白质构建体上引入荧光标签。然而,与FSEC相比,热稳定性测定的缺点是必须使用纯化的蛋白质,并且该测定与所有蛋白质构建体不兼容,因为它依赖于折叠蛋白质中天然半胱氨酸残基的优势位置。
另一种与FSEC和基于荧光团的热稳定性测定有相似之处的方法是测量膜蛋白的温度灵敏度的测定。在该测定中,蛋白质受到不同温度的挑战,并且检测离心后残留在溶液中的蛋白质。该方法的检测以多种方式进行,包括测量溶液18中的荧光、SDS-PAGE凝胶带19的荧光或蛋白质印迹20中的信号强度。然而,这些方法的一个显着缺点是该测定非常劳动密集型,并且结果中容易产生高噪声,因为每个单独的温度点必须独立收集。
最后,可以使用几种更先进的生物物理技术以类似于FSEC的方式评估膜蛋白质量,例如,流诱导分散分析21,微尺度热泳22或SPR。虽然这些方法非常强大,但缺点是需要高度专业化的仪器来运行分析。
总之,FSEC为膜蛋白生产活动提供了宝贵的工具,尽管它不是唯一的选择,但它与其他方法相比具有几个明显的优势,如上所述。始终建议通过正交测定对结果进行交叉验证,并且上面讨论的方法都不是相互排斥的。
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢整个Peak Protein团队的帮助和支持。来自细胞科学团队,我们要感谢Ian Hampton在昆虫细胞表达方面的宝贵见解和指导。我们要感谢Mark Abbott提供资源和机会来开展这个项目。
1 mL and 5 mL plastic syringes | Generic | - | Syringes for transfer of samples |
10x EDTA Free Protease inhibitor cocktail | Abcam | ab201111 | Protease inhibitors |
15 mL tubes | Generic | - | 15 mL tubes for pellet preparation and solubilisation |
2 mL ultra-centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344625 | Tubes for ultra-centrifuge rotor |
50 mL tubes | Generic | - | 50 mL tubes for cell harvest |
96 deep-well blocks | Greiner | 15922302 | For collecting 0.2 mL SEC fractions |
ÄKTA V9-L loop valve | Cytiva | 29011358 | 5 posiiton loop valve for the ÄKTA FPLC system |
ÄKTA F9-C fraction collector | Cytiva | 29027743 | 6 position plate fraction collector for the ÄKTA FPLC system |
ÄKTA pure 25 L | Cytiva | 29018224 | FPLC system for running the experiment |
Benchtop centrifuge (e.g. Fisherbrand GT4 3L) | Fisher Scientific | 15828722 | Centrifuge for low-speed spin |
Blunt end filling needles | Generic | - | For transfer of samples |
Bottle top vacuum filter | Corning | 10005490 | Bottle top vacuum filter for filtering SEC buffers |
Cholesteryl hemisuccinate (CHS) | Generon | CH210-5GM | Additive for detergent solubilisation |
Disposable multichannel reseviour | Generic | - | Resevior for addition of water or buffer to 96-well micro-plate |
Dodecyl maltoside (DDM) | Glycon | D97002-C-25g | Detergent for solubilisation |
eGFP protein standards | BioVision | K815-100 | eGFP standards for fluorescent calibration curve |
Glycerol | Thermo Scientific | 11443297 | Glycerol for buffer preparation |
HEPES | Thermo Scientific | 10411451 | HEPES for buffer preparation |
High molecular weight SEC calibration standards kit | Cytiva | 28403842 | Molecular weight calibration kit for SEC |
Lauryl maltose neopentylglycol (LMNG) | Generon | NB-19-0055-5G | Detergent for solubilisation |
Low molecular weight SEC calibration standards kit | Cytiva | 28403841 | Molecular weight calibration kit for SEC |
MLA-130 ultra-centrifuge rotor | Beckman Coulter | 367114 | Rotor for ultracentrifuge that fits 2 mL capacity tubes |
Opaque 96-well flat-bottom micro-plate | Corning | 10656853 | 96-well for reading fluorescent signal in plate reader |
Optima MAX-XP ultra-centrifuge | Beckman Coulter | 393315 | Centrifuge for high-speed spin |
pH meter | Generic | - | For adjusting the pH of buffers during preparation |
Prism | GraphPad | - | Graphing software for plotting traces |
Rotary mixer | Fisher Scientific | 12027144 | Mixer for end over end mixing in the cold |
Sodium chloride | Fisher Scientific | 10316943 | Sodium chloride for buffer preparation |
Sodium hydroxide | Fisher Scientific | 10488790 | Sodium hydroxide for buffer preparation |
Spectramax ID3 Plate Reader | Molecular Devices | 735-0391 | Micro-plate reader capable of reading fluorescence |
Stirrer plate | Generic | - | For stirring buffers during preparation |
Styrene maleic acid (SMA) | Orbiscope | SMALP 300 | Polymer for detergent free extraction |
Superdex 200 Increase 10/300 GL | Cytiva | 28990944 | SEC column for running the experiment. The bed volume of this column is 24 mL. The recommended flow rate for this column in 0.9 ml/min (in water at 4 °C). The maximum pressure limit for this column is 5 MPa. |
Vacuum pump | Sartorius | 16694-2-50-06 | For filtering and degassing buffers |