Настоящий протокол описывает оптимизированный метод гистологического наблюдения галлов, индуцированных Plasmodiophora brassicae. Вибратомные участки гипокотилов очищаются перед флуоресцентной визуализацией для изучения участия факторов транскрипции и фитогормонов во время прогрессирования заболевания. Этот протокол преодолевает ограничения по встраиванию смолы, позволяя в растении визуализировать флуоресцентные белки.
Заражение культур Brassica почвенным протистом Plasmodiophora brassicae приводит к образованию галла на подземных органах. Образование галлов требует клеточного перепрограммирования и изменения метаболизма зараженного растения. Это необходимо для установления патогенно-ориентированного физиологического поглотителя, к которому перенаправляются питательные вещества хозяина. Для полного понимания этого конкретного взаимодействия растений и патогенов и механизмов, с помощью которых рост и развитие хозяина подрываются и перестраиваются, важно отслеживать и наблюдать внутренние изменения, сопровождающие образование желчи с клеточным разрешением. Методы, сочетающие флуоресцентные пятна и флуоресцентные белки, часто используются для изучения анатомических и физиологических реакций у растений. К сожалению, большой размер галлов и их низкая прозрачность действуют как основные препятствия при выполнении наблюдений под микроскопом. Кроме того, низкая прозрачность ограничивает использование флуоресцентной микроскопии для изучения прогрессирования клубневого заболевания и образования желчи. В этой статье представлен оптимизированный метод фиксации и очистки галлов для облегчения эпифлуоресценции и конфокальной микроскопии для осмотра P. brassicae-инфицированных галлов. Был использован протокол очистки тканей для быстрой оптической очистки с последующим вибратомным сечением для обнаружения анатомических изменений и локализации экспрессии генов с помощью промоторных слияний и репортерных линий, помеченных флуоресцентными белками. Этот метод окажется полезным для изучения клеточных и физиологических реакций в других патогенных структурах растений, таких как нематода-индуцированная синцития и корневые узлы, а также галлы листьев и деформации, вызванные насекомыми.
Растения, пораженные патогенами или насекомыми, могут развивать аномальные структуры (деформации органов или галлы), которые позволяют захватчику глотать питательные вещества иразмножаться 1. Здесь был предпринят эффективный гистопатологический подход для изучения изменений, происходящих в галлах, которые развиваются на подземных частях растений, зараженных протистом Plasmodiophora brassicae (рисунок 1). Незначительная нить, связанная с этим патогеном, возникает из того факта, что споры покоя P. brassicae могут сохранять свою способность вторгаться в растения в течение многих лет. В случае масштабного выращивания масличного рапса (Brassica napus) это серьезная проблема, поскольку экономические факторы ограничивают севооборот, приводя к накоплению спор в почве2. Устойчивость масличного рапса к булавой болезни, вызванной P. brassicae , генетически детерминирована. К сожалению, патоген часто перехитрил резистентность из-за своей биологии и узкого генетического пула, из которого произошел рапс. Поэтому стало актуальным изучение постинфекционных реакций у растений-хозяев и их способности замедлять прогрессирование заболевания или предотвращать развитие определенных симптомов.
При клубневых заболеваниях тяжесть обычно оценивается на основе развития галлов и степени повреждения корневой системы. Это называется индексом заболеваний-DI3. Однако он не в полной мере отражает истинную оценку этого взаимодействия растений и патогенов. В частности, в нем не рассматривается, как патоген распределяется внутри корней и может ли растение сдерживать P. brassicae движение внутри его тканей. Кроме того, нелегко предвидеть, в какой степени P. brassicae перепрограммирует подземную анатомию органа. Исследования на модельном заводе Arabidopsis thaliana показали, что P. brassicae инфекция приводит к ингибированию ксилогенеза (как на стадии инициации, так и на стадии созревания) и усилению дифференцировки флоэмы в галлах4,5. Более того, в корнях и гипокотилах зараженных растений потомство камбиальных клеток не выходит из митотического состояния и размножается дольше, чем у здоровых растений.6. Этот процесс управляет конечным размером галла и определяет количество спор патогена, находящихся в состоянии покоя, продуцируемых внутри зараженного растения. P. brassicae-управляемое развитие, метаболическое и физиологическое перепрограммирование у хозяина очень сложно7; поэтому применение инструментов, позволяющих контролировать внутренние изменения в галлах, имеет решающее значение для правильной оценки этого взаимодействия. Прогрессия жизненного цикла P. brassicae сопровождается перепрограммированием клеточного метаболизма хозяина, который может наблюдаться в виде крахмала или липидного отложения7,8. Основным препятствием для успешной микроскопии галлов является их низкая прозрачность. Из-за этого большинство гистологических образцов, представляющих клубневые изменения в галлах, происходят от методов фиксации-встраивания (воск или смола) с последующим сечением микротомов. Такие подходы были успешно использованы для определения активности промотора для многочисленных генов, активных в клубневых галлах.4,5 или различные методы окрашивания, облегчающие наблюдение P. brassicae прогрессирование жизненного цикла9. Однако следует отметить, что этапы фиксации и встраивания являются трудоемкими и приводят к частичному или полному вымыванию важных биомолекул (например, липидов), что значительно затрудняет некоторые наблюдения. Недавно P. brassicae прогрессирование жизненного цикла у хозяина визуализировали с помощью флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), в которой метилтрансфераза типа SABATH (PbBSMT) генно-специфический зонд был использован для маркировки образования спор в состоянии покоя10. Хорошей альтернативой является использование других методов на основе флуоресценции, где можно увидеть автофлуоресценцию некоторых клеточных компонентов, активность 5′-восходящих регуляторных областей генов, слитых с флуоресцентными белковыми маркерами, и накопление определенных флуоресцентно помеченных белков. Однако, помимо низкой прозрачности образцов, основным недостатком, связанным с такими объектами, является работа с нефиксированными образцами, что значительно сокращает время, в течение которого изображения хорошего качества могут быть задокументированы. В 2015 году Курихара и др.11 разработан очищающий реагент, который позволяет сохранять флуоресцентные белки и повышает прозрачность образцов растительной ткани. Кроме того, он совместим с многочисленными гистологическими пятнами. Недавно эта же методика была успешно применена для визуализации различных компонентов клеточной стенки в тканях растений.12,13. Здесь этот протокол был использован для анализа различных аспектов развития булавой желчи. Рабочий процесс начинается с фиксации галлов, сечения вибратома, очистки тканей, окрашивания и флуоресцентной визуализации. В зависимости от потребностей, непосредственно или после конкретного окрашивания, полученные участки могут быть подвергнуты осмотру под эпифлуоресцентным или конфокальным микроскопом. Этот метод обеспечивает эффективное решение для изучения локальных изменений экспрессии генов и физиологических реакций, включая фитогормональный баланс и передачу сигналов. Прогрессирование заболевания можно отследить, посмотрев на структуру распределения спор покоя и динамику созревания. Кроме того, протокол может быть легко применен для визуализации изменений характеристик в пределах P. brassicae зараженные растения, включая ингибирование ксилогенеза или защитные реакции растений-хозяев, видимых как локальная лигнификация в резистентных генотипах. Примеры в этом протоколе взяты из изображений, проведенных на Arabidopsis thaliana модель; однако протокол может также применяться к другим видам сельскохозяйственных культур, принадлежащим к Brassicaceae семья. Метод, описанный ниже, облегчит будущие детальные исследования клеточных структур и молекулярных изменений, сопровождающих образование желчи в P. brassicae-зараженные растения.
Общий рабочий процесс протокола довольно прост, и все этапы развития желчи можно легко сфотографировать и охарактеризовать (рисунок 2). Поскольку P. brassicae является почвенным патогеном, все эксперименты должны проводиться в почвенных системах. Возбудитель предпочитает кислые условия; поэтому необходимо использовать почвенные субстраты, не обработанные известью. Хотя P. brassicae не представляет угрозы для человека, он является строго растительным патогеном, который может распространяться через почву и воду. Поэтому все части зараженного растения, а также почву нужно уничтожить после эксперимента автоклавированием или обработкой отбеливателем.
Нанесение очищающего раствора на вибратомные срезы галлов, безусловно, повышает способность изучать биотрофное взаимодействие между P. brassicae и растением-хозяином. Хотя протокол очистки применяется даже к ручным секциям, он лучше работает с секциями вибратома. Фиксация образцов в фиксаторе PFA действует как критический шаг в протоколе, поскольку образцы затем могут храниться при 4 ° C в течение нескольких дней, прежде чем приступить к разделению. Это обеспечивает гибкость для хранения образцов в течение ограниченного периода времени без ущерба для экспрессии и сохранения флуоресцентных белков во время фиксации.
Красный нил (в ДМСО или метаноле) несовместим со смоляными срезами из-за своей гидрофобности, которая растворяет смолу и разрушает встроенные в смолу участки17. Таким образом, вибратомные участки оказываются полезными для изучения распространения патогена и его жизненного цикла в развивающихся галлах, при этом окрашивание в красный нил может быть легко использовано.
Очищающий раствор, используемый в этом протоколе, является очень универсальным12, что позволяет использовать различные флуоресцентные пятна в различных комбинациях для окрашивания различных биомолекул / компонентов клеточных стенок (суберин, лигнин, целлюлоза и хитин в грибковых взаимодействиях). Также можно противодействовать участкам флуоресцентных маркерных линий GFP и тем самым коррелировать промоторную активность или паттерн накопления белка с присутствием патогена в конкретных клетках или областях желчи. Однако фоновая автофлуоресценция от ксилемы и заполненных патогенами гигантских клеток не могла быть устранена даже после протокола очистки. Это представляет собой ограничение для изучения флуоресцентных маркеров на более поздних стадиях образования желчи, особенно при использовании эпифлуоресцентного микроскопа и визуализации слабых сигналов.
Из-за низкого уровня экспрессии/накопления флуоресцентных сигналов факторы транскрипции трудно обнаружить, но с помощью этого метода можно получить удовлетворительные изображения для них. В целом, сочетание вибратомного сечения с подходом очистки тканей расширяет инструментарий для гистологических наблюдений сложных желчных тканей. Гибкость этого протокола облегчает процесс фиксации тканей и сокращает время, необходимое для разрезания и визуализации свежих образцов тканей для наблюдения флуоресцентных белков и промоторной активности. С дальнейшими улучшениями и использованием других флуоресцентных красителей, специфичных для различных биомолекул, этот метод будет означать большие успехи в гистологических исследованиях и анализе изображений плотных, непрозрачных тканей со сложной организацией тканей. В последнее время представленный метод очистки тканей стал популярным и широко используемым протоколом для объединения и обеспечения возможности одновременного получения различных флуоресцентных сигналов 11,12,13. Будущее развитие и модификации таких методов значительно улучшат разрешение изображения для наблюдения за взаимодействиями растений и патогенов на клеточном уровне.
The authors have nothing to disclose.
Работа была поддержана грантом Национального научного центра Польши OPUS17 No 2019/33/B/NZ9/00751 «Междугородняя сосудистая координация у растений, инфицированных Plasmodiophora brassicae». Мы благодарим профессора Юрьо Хелариутту (Sainsbury Laboratory, Кембриджский университет) за то, что он поделился линией proHCA2::erRFP .
2N Sulfuric acid (H2SO4) | Roth | UN2796 | pH adjustment |
Agarose | PRONA | BGQT100 | Embedding |
Basic Fuchsin | BIOSHOP | BSF410.5 | Fluorescent dye |
Calcofluor White | Sigma Aldrich | 18909-100ML-F | Fluorescent dye |
Commercial Bleach | Domestos | ||
Cyanoacrylate/ Instant glue | Kropelka | Adhesive | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | BIOSHOP | DMS555.500 | Solvent |
Epifluorescence microscope | Carl Zeiss M2 automated epifluorescence microscope with Colibri LED system | Carl Zeiss M2 | Carl Zeiss Filter Set filter set 38, 43, 49 used |
Fully automated Vibratome | Leica | VT1200 S | |
Lightmeter /Photometer | LI-COR Biosciences | LI-250A + LI-190R quantum sensor | For measuring light intensity within the 400-700nm (PAR) waveband |
Masking tape | For sticking agarose block on mould | ||
Murashige & Skoog Medium (MS Medium) | Duchefa Biochemie | MO222.0050 | Plant Growth Medium |
Nile Red | Sigma Aldrich | N3013-100MG | Fluorescent dye |
Paraformaldehyde PFA | Sigma Aldrich | 158127-100G | Fixative |
Potassium Chloride (KCl) | POCH | 739740114 | PBS component |
Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | P1767-250G | pH adjustment |
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | BIOSHOP | PPM302.500 | PBS component |
Sodium chloride (NaCl) | BIOSHOP | SOD001.1 | PBS component |
Sodium Deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750-25G | Clearing Solution |
Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4 · 2H2O) | POCH | 799490116 | PBS component |
Triton X-100 | BIOSHOP | TRX506.100 | Fixative |
Urea | Sigma Aldrich | U5378-100G | Clearing Solution |
Vacuum/Pressure pump and Dessicator | Welch by Gardner Denver | 2522C-02 | For Vacuum Infilteration |
Xylitol | Sigma Aldrich | X3375-25G | Clearing Solution (componenet) |