Het huidige protocol beschrijft een geoptimaliseerde methode voor de histologische observatie van gallen geïnduceerd door Plasmodiophora brassicae. Vibratome-secties van hypocotylen worden gewist vóór fluorescentiebeeldvorming om de betrokkenheid van transcriptiefactoren en fytohormonen tijdens ziekteprogressie te bestuderen. Dit protocol overwint de beperkingen van de inbedding van hars, waardoor planta-visualisatie van fluorescerende eiwitten mogelijk wordt.
Infectie van Brassica-gewassen door de bodemgebonden protist Plasmodiophora brassicae leidt tot galvorming op de ondergrondse organen. De vorming van gallen vereist cellulaire herprogrammering en veranderingen in het metabolisme van de geïnfecteerde plant. Dit is nodig om een pathogeen-georiënteerde fysiologische sink vast te stellen waarnaar de voedingsstoffen van de gastheer worden omgeleid. Voor een volledig begrip van deze specifieke plant-pathogeen interactie en de mechanismen waarmee gastheergroei en -ontwikkeling worden ondermijnd en gerepatterd, is het essentieel om de interne veranderingen die gepaard gaan met galvorming met cellulaire resolutie te volgen en te observeren. Methoden die fluorescerende vlekken en fluorescerende eiwitten combineren, worden vaak gebruikt om anatomische en fysiologische reacties in planten te bestuderen. Helaas fungeren de grote omvang van gallen en hun lage transparantie als belangrijke hindernissen bij het uitvoeren van waarnemingen van de hele montage onder de microscoop. Bovendien beperkt lage transparantie het gebruik van fluorescentiemicroscopie om de progressie en galvorming van clubrootziekte te bestuderen. Dit artikel presenteert een geoptimaliseerde methode voor het fixeren en verwijderen van gallen om epifluorescentie en confocale microscopie te vergemakkelijken voor het inspecteren van P. brassicae-geïnfecteerde gallen. Een weefselzuiveringsprotocol voor snelle optische clearing werd gebruikt, gevolgd door vibratome-secties om anatomische veranderingen te detecteren en genexpressie te lokaliseren met promotorfusies en reporterlijnen die zijn getagd met fluorescerende eiwitten. Deze methode zal nuttig zijn voor het bestuderen van cellulaire en fysiologische reacties in andere door pathogenen geactiveerde structuren in planten, zoals door nematoden geïnduceerde syncytia en wortelknopen, evenals bladgallen en vervormingen veroorzaakt door insecten.
Planten die zijn aangetast door ziekteverwekkers of insecten kunnen abnormale structuren ontwikkelen (orgaanvervormingen of gallen), waardoor de indringer voedingsstoffen kan opnemen en zich kan voortplanten1. Hier werd een efficiënte histopathologische benadering gevolgd om de veranderingen te bestuderen die plaatsvinden in gallen die zich ontwikkelen op de ondergrondse delen van planten die zijn geïnfecteerd met de protist Plasmodiophora brassicae (figuur 1). De kleine draad die geassocieerd wordt met deze ziekteverwekker komt voort uit het feit dat P. brassicae rustende sporen hun vermogen om planten binnen te dringen vele jaren kunnen behouden. In het geval van grootschalige teelt van koolzaad (Brassica napus) is dit een ernstig probleem, aangezien economische factoren de vruchtwisseling beperken, wat leidt tot sporenophoping in de bodem2. De weerstand van koolzaad tegen clubrootziekte veroorzaakt door P. brassicae is genetisch bepaald. Helaas is de ziekteverwekker vaak de resistentie te slim af vanwege zijn biologie en de smalle genetische pool waaruit koolzaad is ontstaan. Daarom is het relevant geworden om de post-infectieresponsen in waardplanten te bestuderen en hun vermogen om de progressie van de ziekte te vertragen of te voorkomen dat bepaalde symptomen zich ontwikkelen.
Bij clubrootziekte wordt de ernst over het algemeen geëvalueerd op basis van de ontwikkeling van gallen en de mate van schade aan het wortelstelsel. Dit staat bekend als de Disease Index-DI3. Het geeft echter niet volledig de ware beoordeling van deze plant-pathogeen interactie weer. In het bijzonder gaat het niet in op hoe het pathogeen in de wortels wordt verdeeld en of de plant zich kan bedwingen P. brassicae beweging in zijn weefsels. Verder is het niet eenvoudig om te anticiperen in welke mate P. brassicae herprogrammeert ondergrondse orgaananatomie. Studies over de modelfabriek Arabidopsis thaliana hebben aangetoond dat P. brassicae infectie leidt tot de remming van xylogenese (zowel de initiatie- als rijpingsstappen) en de verbetering van floëemdifferentiatie in gallen4,5. Bovendien, in wortels en hypocotylen van geïnfecteerde planten, verlaat cambiale cel nakomelingen de mitotische toestand niet en prolifereert langer dan in gezonde planten6. Dit proces regelt de uiteindelijke grootte van de gal en bepaalt het aantal pathogene rustsporen dat in de geïnfecteerde plant wordt geproduceerd. P. brassicae-gedreven ontwikkelings-, metabole en fysiologische herprogrammering in de gastheer is zeer complex7; daarom is de toepassing van hulpmiddelen die de inspectie van interne veranderingen in gallen mogelijk maken, cruciaal voor het goed beoordelen van deze interactie. De levenscyclusprogressie van P. brassicae gaat gepaard met herprogrammering van het metabolisme van de gastheercel, dat kan worden waargenomen als zetmeel- of lipideafzetting7,8. Het belangrijkste obstakel voor de succesvolle microscopie van gallen komt van hun lage transparantie. Hierdoor zijn de meeste histologische specimens die clubroot-gedreven veranderingen in gallen vertonen, afkomstig van fixatie-inbedding (was of hars) technieken gevolgd door microtoomsectie. Dergelijke benaderingen werden met succes gebruikt voor het lokaliseren van de promotoractiviteit voor tal van genen die actief zijn in clubroot galls4,5 of verschillende kleuringstechnieken die de waarneming van P. brassicae progressie van de levenscyclus9. Er moet echter worden opgemerkt dat de fixatie- en inbeddingsfasen tijdrovend zijn en resulteren in gedeeltelijke of volledige uitspoeling van belangrijke biomoleculen (bijv. Lipiden), waardoor bepaalde waarnemingen aanzienlijk worden belemmerd. Onlangs P. brassicae levenscyclusprogressie in de gastheer werd gevisualiseerd met behulp van de fluorescente in situ hybridisatie (FISH), waarbij een SABATH-type methyltransferase (PbBSMT) genspecifieke sonde werd gebruikt om de vorming van sporen in rust te markeren10. Een goed alternatief is het gebruik van andere op fluorescentie gebaseerde methoden waarbij de autofluorescentie van sommige cellulaire componenten, de activiteit van 5′- stroomopwaarts regulerende regio’s van genen gefuseerd tot fluorescerende eiwitmarkers en de accumulatie van bepaalde fluorescerend getagde eiwitten kunnen worden gezien. Naast de lage transparantie van de monsters is een groot nadeel van dergelijke objecten het werken met niet-gefixeerde exemplaren, waardoor de tijd waarin afbeeldingen van goede kwaliteit kunnen worden gedocumenteerd, aanzienlijk wordt verkort. In 2015 hebben Kurihara et al.11 ontwikkelde een clearing reagens, dat het behoud van fluorescerende eiwitten mogelijk maakt en de transparantie van plantenweefselmonsters verhoogt. Bovendien is het compatibel met tal van histologische vlekken. Onlangs werd dezelfde techniek met succes toegepast om verschillende celwandcomponenten in plantenweefsels te visualiseren12,13. Hier is dit protocol gebruikt om verschillende aspecten van de ontwikkeling van clubwortelgalen te analyseren. De workflow begint met de fixatie van gallen, vibratomsectie, weefselzuivering, kleuring en fluorescentiebeeldvorming. Afhankelijk van iemands behoeften, direct of na bepaalde kleuring, kunnen de resulterende secties worden onderworpen aan inspectie onder een epifluorescentie of confocale microscoop. Deze methode biedt een effectieve oplossing om lokale veranderingen in genexpressie en fysiologische reacties te bestuderen, inclusief fytohormoonbalans en signalering. Ziekteprogressie kan worden gevolgd door te kijken naar het distributiepatroon van rustende sporen en rijpingsdynamiek. Bovendien kan het protocol eenvoudig worden toegepast voor veranderingen in de beeldkarakteristiek binnen P. brassicae geïnfecteerde planten, inclusief de remming van xylogenese of de verdedigingsreacties van de waardplant die zichtbaar zijn als lokale lignificatie in resistente genotypen. Voorbeelden in dit protocol zijn afkomstig van beeldvorming uitgevoerd op de Arabidopsis thaliana model; het protocol kan echter ook worden toegepast op andere gewassoorten die behoren tot de Brassicaceae Familie. De hieronder beschreven methode zal toekomstige gedetailleerde studies van cellulaire structuren en moleculaire veranderingen die gepaard gaan met galvorming in P. brassicae-geïnfecteerde planten.
De algemene workflow van het protocol is vrij eenvoudig en alle stadia van galontwikkeling kunnen gemakkelijk worden afgebeeld en gekarakteriseerd (figuur 2). Aangezien P. brassicae een bodempathogeen is, moeten alle experimenten worden uitgevoerd in bodemsystemen. De ziekteverwekker geeft de voorkeur aan zure omstandigheden; daarom moeten niet-kalkbehandelde bodemsubstraten worden gebruikt. Hoewel P. brassicae geen bedreiging vormt voor de mens, is het strikt een plantpathogeen dat zich via bodem en water kan verspreiden. Daarom moeten alle delen van de geïnfecteerde plant, evenals de grond, na het experiment worden vernietigd door autoclaveren of door behandeling met bleekmiddel.
Het aanbrengen van de clearingoplossing op door vibratomen gesneden delen van gallen verbetert zeker het vermogen om de biotrofe interactie tussen P. brassicae en de waardplant te bestuderen. Hoewel het clearingprotocol zelfs van toepassing is op handsecties, werkt het beter met vibratomsecties. Het fixeren van monsters in PFA-fixatief fungeert als een kritieke stap in het protocol, omdat monsters vervolgens enkele dagen bij 4 °C kunnen worden bewaard voordat ze doorgaan met secties. Dit biedt flexibiliteit om monsters voor een beperkte periode op te slaan zonder de expressie en het behoud van fluorescerende eiwitten tijdens fixatie in gevaar te brengen.
Nile Red (in DMSO of methanol) is onverenigbaar met harssecties vanwege de hydrofobiciteit, die hars oplost en in hars ingebedde secties17 vernietigt. Vibratome-secties blijken dus instrumenteel voor het bestuderen van de pathogene distributie en de levenscyclus ervan in zich ontwikkelende gallen, waarbij Nijlrode kleuring gemakkelijk kan worden gebruikt.
De clearingoplossing die in dit protocol wordt gebruikt, is zeer veelzijdig12, waardoor een verscheidenheid aan fluorescentievlekken in verschillende combinaties kan worden gebruikt om verschillende biomoleculen / componenten van de celwanden te kleuren (suberine, lignine, cellulose en chitine in schimmelinteracties). Het is ook mogelijk om secties van fluorescerende GFP-markerlijnen te counterstainen en daardoor de promotoractiviteit of het eiwitaccumulatiepatroon te correleren met de aanwezigheid van het pathogeen in bepaalde cellen of regio’s van de gal. Achtergrondautofluorescentie van xyleem en met pathogenen gevulde reuzencellen kon echter niet worden geëlimineerd, zelfs niet na het clearingprotocol. Dit vormt een beperking voor het kijken naar fluorescerende markers tijdens de latere stadia van galvorming, vooral bij het gebruik van een epifluorescentiemicroscoop en het afbeelden van zwakke signalen.
Vanwege de lage niveaus van expressie / accumulatie van fluorescerende signalen zijn transcriptiefactoren moeilijk te detecteren, maar met deze techniek is het mogelijk om bevredigende beelden voor hen te verkrijgen. Over het algemeen breidt het combineren van vibratomsectie met de weefselzuiveringsbenadering de toolkit uit voor histologische observaties van complexe galweefsels. De flexibiliteit van dit protocol vergemakkelijkt het proces van weefselfixatie en vermindert de tijd die nodig is voor het snijden en afbeelden van verse weefselmonsters om fluorescerende eiwitten en promotoractiviteiten te observeren. Met verdere verbeteringen en door gebruik te maken van andere fluorescerende kleurstoffen die specifiek zijn voor verschillende biomoleculen, zal deze methode grotere vooruitgang betekenen in histologische studies en beeldanalyse van dichte, ondoorzichtige weefsels met complexe weefselorganisatie. In de afgelopen tijd is de gepresenteerde weefselzuiveringsmethode naar voren gekomen als een populair en veelgebruikt protocol om de gelijktijdige acquisitie van verschillende fluorescerende signalen te combineren en mogelijk te maken 11,12,13. Toekomstige ontwikkeling en modificaties in dergelijke technieken zullen de beeldresolutie voor het observeren van plant-pathogeeninteracties op cellulair niveau aanzienlijk verbeteren.
The authors have nothing to disclose.
Het werk werd ondersteund door het National Science Centre Poland OPUS17 grant No. 2019/33/B/NZ9/00751 “Long distance Vascular Coordination in Plants Infected by Plasmodiophora brassicae“. We danken Prof. Yrjö Helariutta (Sainsbury Laboratory, University of Cambridge) voor het delen van de proHCA2::erRFP-lijn .
2N Sulfuric acid (H2SO4) | Roth | UN2796 | pH adjustment |
Agarose | PRONA | BGQT100 | Embedding |
Basic Fuchsin | BIOSHOP | BSF410.5 | Fluorescent dye |
Calcofluor White | Sigma Aldrich | 18909-100ML-F | Fluorescent dye |
Commercial Bleach | Domestos | ||
Cyanoacrylate/ Instant glue | Kropelka | Adhesive | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | BIOSHOP | DMS555.500 | Solvent |
Epifluorescence microscope | Carl Zeiss M2 automated epifluorescence microscope with Colibri LED system | Carl Zeiss M2 | Carl Zeiss Filter Set filter set 38, 43, 49 used |
Fully automated Vibratome | Leica | VT1200 S | |
Lightmeter /Photometer | LI-COR Biosciences | LI-250A + LI-190R quantum sensor | For measuring light intensity within the 400-700nm (PAR) waveband |
Masking tape | For sticking agarose block on mould | ||
Murashige & Skoog Medium (MS Medium) | Duchefa Biochemie | MO222.0050 | Plant Growth Medium |
Nile Red | Sigma Aldrich | N3013-100MG | Fluorescent dye |
Paraformaldehyde PFA | Sigma Aldrich | 158127-100G | Fixative |
Potassium Chloride (KCl) | POCH | 739740114 | PBS component |
Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | P1767-250G | pH adjustment |
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | BIOSHOP | PPM302.500 | PBS component |
Sodium chloride (NaCl) | BIOSHOP | SOD001.1 | PBS component |
Sodium Deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750-25G | Clearing Solution |
Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4 · 2H2O) | POCH | 799490116 | PBS component |
Triton X-100 | BIOSHOP | TRX506.100 | Fixative |
Urea | Sigma Aldrich | U5378-100G | Clearing Solution |
Vacuum/Pressure pump and Dessicator | Welch by Gardner Denver | 2522C-02 | For Vacuum Infilteration |
Xylitol | Sigma Aldrich | X3375-25G | Clearing Solution (componenet) |